
==== Front
Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban
Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban
zndx
Journal of Central South University Medical Sciences
1672-7347
中南大学出版社 湖南省长沙市湘雅路110号湘雅医学院

39311783
1672-7347(2024)06-0870-08
240020
10.11817/j.issn.1672-7347.2024.240020
Articles
B4GALNT1表达下调抑制骨肉瘤细胞增殖和转移
Downregulation of B4GALNT1 inhibits proliferation and metastasis of osteosarcoma cellshttp://orcid.org/0000-0002-2676-811X
李 帅 LI Shuai 12
http://orcid.org/0000-0002-9647-5275
王 冰 WANG Bing 12
陈 夏 CHEN Xia 3
涂 超 TU Chao 3
彭 丹 PENG Dan 3
戴 瑜亮 DAI Yuliang 12
1 中南大学湘雅二医院脊柱外科 长沙 410011
1 Department of Spine, Second Xiangya Hospital, Central South University Changsha 410011
2 湖南省数字化脊柱外科临床研究中心 长沙 410011
2 Hunan Provincial Digital Spine Research Institute Changsha 410011
3 中南大学湘雅二医院骨科 长沙 410011
3 Department of Orthopadics, Second Xiangya Hospital, Central South University Changsha 410011 China
彭 敏宁 executive-editor
王冰，Email: wbxyeyy@csu.edu.cn, ORCID: 0000-0002-9647-5275
李帅，Email: lishuai1019@csu.edu.cn, ORCID: 0000-0002-2676-811X

28 6 2024
49 6 870877
08 1 2024
©Journal of Central South University (Medical Science). All rights reserved.
2024
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ 开放获取(Open access)：本文遵循知识共享许可协议，允许第三方用户按照署名-非商业性使用-禁止演绎4.0(CC BY-NC-ND 4.0)的方式，在任何媒介以任何形式复制、传播本作品(https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。
目的

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的骨恶性肿瘤，具有极强的增殖和转移潜能。伴有远处转移的骨肉瘤患者的生存预后极差，且骨肉瘤患者在治疗过程中易出现病灶切除不彻底、化学治疗耐药等难题，目前尚缺乏有效的根治手段。近年来，越来越多的证据表明β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶1(β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 1，B4GALNT1)能够影响多种恶性肿瘤的进展。然而，B4GALNT1在骨肉瘤细胞中的功能却未见报道。本研究拟探讨骨肉瘤组织与正常组织中B4GALNT1的表达以及B4GALNT1对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响，以期为骨肉瘤患者的治疗提供新的理论依据和方向。

方法

收集在中南大学湘雅二医院行骨肉瘤瘤段切除的16例患者的肿瘤组织及相对应的正常组织样本，骨肉瘤患者的年龄为8~17(中位数12)岁。利用实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR)检测B4GALNT1 mRNA在骨肉瘤组织、相对应的正常组织、3种骨肉瘤细胞系(MG63、Saos-2、U2OS)及人成骨细胞(human fetal osteoblastic，hFOB)中的表达情况；通过细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)及克隆形成实验分析敲减B4GALNT1对骨肉瘤细胞Saos-2及U2OS增殖能力的影响；利用Transwell迁移和侵袭实验分析敲减B4GALNT1对骨肉瘤细胞Saos-2及U2OS迁移和侵袭能力的影响；使用蛋白质印迹法分析敲减B4GALNT1对Saos-2及U2OS细胞上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及侵袭相关蛋白质表达的影响。

结果

Real-time RT-PCR结果表明：与正常组织及hFOB相比，骨肉瘤组织和3种骨肉瘤细胞系中B4GALNT1 mRNA的表达水平较高(均P<0.01)。CCK-8及克隆形成实验结果表明：与对照组相比，敲减B4GALNT1降低了骨肉瘤细胞的增殖速率(均P<0.05)。Transwell迁移和侵袭实验结果表明：与对照组相比，敲减B4GALNT1减少了骨肉瘤细胞的迁移和侵袭细胞数(均P<0.01)。蛋白质印迹结果表明：与对照组相比，敲减B4GALNT1抑制了N-cadherin、Snail、Vimentin和基质金属蛋白酶9(matrix metallopreteinase 9，MMP9)的表达(均P<0.01)。

结论

B4GALNT1在骨肉瘤组织及细胞系中表达上调；敲减B4GALNT1抑制了骨肉瘤的恶性表型；B4GALNT1可能作为一个癌基因在骨肉瘤细胞增殖和转移中发挥重要作用。

Objective

Osteosarcoma is the most common malignant bone tumor in children and adolescents, characterized by a high potential for proliferation and metastasis. Patients with osteosarcoma who have distant metastases generally have a poor prognosis. Challenges in treatment include incomplete resection of tumor and chemotherapy resistance, with no effective cure currently available. Recent studies suggest that β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 1 (B4GALNT1) plays a role in the progression of various malignant tumors. However, the function of B4GALNT1 in osteosarcoma cells has not been reported. This study aims to investigate the expression of B4GALNT1 in osteosarcoma tissues compared to normal tissues and to explore its effects on the proliferation, migration, and invasion of osteosarcoma cells, thereby providing new theoretical foundations and directions for the treatment of osteosarcoma patients.

Methods

Tumor tissues and corresponding normal tissue samples were collected from 16 osteosarcoma patients who underwent tumor resection at the Second Xiangya Hospital of Central South University. The patients’ ages ranged from 8 to 17 years (median age 12 years). The expression of B4GALNT1 mRNA in osteosarcoma tissues, corresponding normal tissues, 3 osteosarcoma cell lines (MG63, Saos-2, and U2OS), and human fetal osteoblastic cells (hFOB) was detected using real-time reverse transcription PCR (real-time RT-PCR). The effects of B4GALNT1 knockdown on the proliferation of osteosarcoma cells Saos-2 and U2OS were analyzed using cell counting kit-8 (CCK-8) assays and colony formation assays. The effects of B4GALNT1 knockdown on the migration and invasion abilities of Saos-2 and U2OS cells were evaluated using Transwell migration and invasion assays. Western blotting analysis was performed to assess the impact of B4GALNT1 knockdown on the expression of epithelial-mesenchymal transition (EMT) and invasion-related proteins in Saos-2 and U2OS cells.

Results

Real-time RT-PCR results showed that B4GALNT1 mRNA expression levels were significantly higher in osteosarcoma tissues and the 3 osteosarcoma cell lines compared to normal tissues and hFOB cells (all P<0.01). CCK-8 and colony formation assays indicated that B4GALNT1 knockdown significantly reduced the proliferation rate of osteosarcoma cells compared to the control group (all P<0.05). Transwell migration and invasion assays demonstrated that B4GALNT1 knockdown significantly decreased the number of migrating and invading osteosarcoma cells (all P<0.01). Western blotting analysis revealed that B4GALNT1 knockdown inhibited the expression of N-cadherin, Snail, Vimentin, and matrix metalloproteinase 9 (MMP9) compared to the control group (all P<0.01).

Conclusion

B4GALNT1 is upregulated in osteosarcoma tissues and cell lines, and its knockdown suppresses the malignant phenotype of osteosarcoma cells. B4GALNT1 may function as an oncogene in the proliferation and metastasis of osteosarcoma cells.

β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶1
骨肉瘤
增殖
上皮-间充质转化
β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 1
osteosarcoma
proliferation
epithelial-mesenchymal transition
湖南省自然科学基金2020JJ5799┫。This work was supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province China ┣2020JJ5799
==== Body
pmc骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤，它主要由间质细胞系发展而来，常见于青少年四肢的骨骺末端[1]。此外，骨肉瘤细胞还具有增殖能力强、侵袭性高及易发生远处转移的特点，与其他恶性肿瘤相比，它更容易发生区域性或全身性转移。当骨肉瘤发生区域性转移时，它可以通过骨内扩散到同一部位的整个骨骼或通过关节间隙(如胫骨和股骨关节囊之间的间隙)扩散，从而形成“跳跃性病变”[2-3]。研究[4]表明：骨肉瘤的发生和发展受到各种生物分子的调节，包括癌基因的激活和抑癌基因的失活、肿瘤微血管的激活和相关生物分子的异常表达。即使骨肉瘤患者接受了手术和新辅助化学治疗(以下简称“化疗”)，其5年生存率也仅为60%~70%，其中，发生转移或对化疗耐药患者的5年生存率则更低[5]。近年来，恶性肿瘤的治疗方法得到了相当大的改进，其中分子靶向治疗使得骨肉瘤患者的治疗变得个体化，并且也获得了不错的疗效[6]。因此，研究骨肉瘤发生、发展的分子机制有助于探索治疗骨肉瘤新的分子靶点，对提高患者的疗效和延长患者的生存期具有重要的临床意义。

β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶1(β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 1，B4GALNT1)是一种参与神经节苷脂合成的关键酶，而神经节苷脂中的单唾液酸神经节苷脂2和双唾液酸神经节苷脂2是重要的癌症抗原，且在多种癌症中高度表达[7-9]。据报道，神经节苷脂能够调节细胞间通信、细胞循环、生长、黏附和分化等行为[10]，它可以加速肺腺癌和肝细胞癌的进展[11-12]。此外，B4GALNT1可以通过促进局灶性黏附和影响Hippo信号通路中关键蛋白质的表达来调控肾透明细胞癌的转移[13]。然而，B4GALNT1在骨肉瘤中的作用目前还尚未见报道，也缺乏能够预测其转移的生物标志物[14]。因此，本研究旨在检测B4GALNT1在骨肉瘤中的表达，并进一步研究其对骨肉瘤增殖、迁移、侵袭和上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影响。

1 材料与方法

1.1 临床组织样本

2020年11月至2022年9月于中南大学湘雅二医院收集16例患者的骨肉瘤及其毗邻的正常组织样本。骨肉瘤患者的年龄为8~17(中位数12)岁。纳入标准：病理结果为骨肉瘤；入院前未做过其他任何治疗。排除标准：存在其他肿瘤病史；其他可能影响治疗过程的潜在疾病。样本获取后在液氮中冷冻保存。本研究获得中南大学湘雅二医院伦理委员会批准(审批号：ASD202303)，并得到所有参与者的知情同意。

1.2 细胞和试剂

骨肉瘤细胞系(MG63、Saos-2、U2OS)和人成骨细胞(human fetal osteoblastic，hFOB)购于中国医学科学院基础医学研究所的细胞资源中心。胎牛血清和DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)为美国Gibco公司产品。TRIzol、反转录试剂盒、PCR试剂盒、细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)和Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。B4GALNT1 siRNA及其阴性对照(siNC)由长沙维尔生物科技有限公司合成。RIPA缓冲液、ECL发光液、PVDF膜、B4GALNT1一抗、N-cadherin一抗、Snail一抗、Vimentin一抗、基质金属蛋白酶9(matrix metallopreteinase 9，MMP9)一抗及羊抗鼠二抗为美国Affinity公司产品。

1.3 细胞培养和转染

将4种细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM中。用Lipofectamine 2000将siNC(正向5'-CCAGAAAC-AAGUCCGAGCUAUTT-3'，反向5'-AUAGCUCG-GACUUGUUUCUGGTT-3')或B4GALNT1 siRNA(正向5'-GCUGCUUUCACUAUCCGCAUATT-3'，反向 5'-UAUGCGGAUAGUGAAAGCAGCTT-3')转染到骨肉瘤细胞中。

1.4 RNA提取和real-time RT-PCR

使用TRIzol提取总RNA。将其在55 ℃下合成cDNA后进行PCR。用于扩增的引物如下： B4GALNT1，正向5'-CAGGCAACTACAACTGGTCA-CTTACA-3'，反向5'-GAGGAAGGTCTTGGTGGCA-ATCG-3'；GAPDH，正向5'-TCAAGAAGGTGGTGA-AGCAGG-3'，反向5'-GCGTCAAAGGTGGAGGAG-TG-3'。反应条件为：95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s和72 ℃ 20 s，进行40个循环。使用2-ΔΔCt法对mRNA水平进行相对定量。

1.5 蛋白质印迹法

用RIPA缓冲液提取总蛋白质，将50 µg总蛋白质行12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，完成后移至PVDF膜上。将一抗与膜孵育1 h，用5% BSA在4 ℃下封闭过夜。所用一抗包括B4GALNT1(1꞉1 000)、N-cadherin(1꞉1 500)、Snail(1꞉1 000)、Vimentin(1꞉1 500)和MMP9(1꞉1 500)。用TBST洗涤膜，再与羊抗鼠二抗(1꞉5 000)孵育1 h后显影。

1.6 CCK-8实验和克隆形成实验

使用CCK-8测定96孔板中的细胞增殖情况，每孔接种5×103个细胞，于24、48、72和96 h添加CCK-8，孵育2 h后测量450 nm处的吸光度值。于6孔板中每孔接种500个细胞，孵育14 d后染色并计算平均菌落数。

1.7 Transwell侵袭和迁移实验

将200 μL含1×105个细胞的悬浮液接种到被基质胶原覆盖的Transwell上腔室中进行侵袭实验。随后，将1 mL含血清的培养基置于下腔室中。在37 ℃下培养过夜后，使用棉签去除非侵入性细胞，将剩余细胞进行固定，在室温下用苏木精染色并计数侵入细胞的数量。以同样的方法将含1×104个细胞的悬浮液接种到未被基质胶原覆盖的Tanswell上腔室中进行迁移实验。

1.8 统计学处理

采用GraphPad Prism软件进行统计分析，正态分布的计量资料以均数±标准差( x¯ ±s)表示。骨肉瘤组织和正常组织中B4GALNT1表达的比较采用配对t检验；多组间比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 B4GALNT1mRNA在骨肉瘤组织和细胞中高表达

Real-time RT-PCR检测结果表明：与正常组织相比，骨肉瘤组织中B4GALNT1 mRNA显著高表达(P<0.01，图1A)；MG63、Saos-2和U2OS中B4GALNT1 mRNA的表达显著高于hFOB(P<0.05，图1B)。

图1 B4GALNT1 mRNA的表达水平( x¯ ±s)

Figure 1 Expression of B4GALNT1 mRNA ( x¯ ±s)

A: Expression of B4GALNT1 mRNA in osteosarcoma tissues and normal tissues, **P<0.01 vs normal; B: Expression of B4GALNT1 mRNA in the cell lines, *P<0.05 vs hFOB. B4GALNT1: β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 1; hFOB: Human fetal osteoblastic.

2.2 敲减 B4GALNT1 抑制了骨肉瘤细胞的增殖

选择具有较高B4GALNT1 mRNA表达水平的Saos-2和U2OS细胞用于B4GALNT1 siRNA转染，结果表明：转染B4GALNT1 siRNA后，2种细胞系中B4GALNT1 mRNA的表达均较siNC组减少(均P<0.01，图2A)。CCK-8实验结果显示：与siNC组相比，siRNA组细胞经培养48 h后，Saos-2和U2OS细胞的增殖速率均明显减慢(均P<0.05，图2B)。克隆形成实验结果表明：在Saos-2和U2OS细胞中，未敲减B4GALNT1的细胞比敲减B4GALNT1的细胞所产生的克隆数多(均P<0.01，图2C、2D)。

图2 敲减 B4GALNT1 对骨肉瘤细胞增殖的影响

Figure 2 Effect of B4GALNT1 siRNAon osteosarcoma cell proliferation

A: Expression of B4GALNT1 in SaOS-2 and U2OS cells transfected with B4GALNT1 siRNA; B: Effect of B4GALNT1siRNA on cell proliferation by CCK-8 assay; C and D: Effect of B4GALNT1 siRNA on cell colony in SaOS-2 (C) and U2OS (D). *P<0.05, **P<0.01 vs siNC. B4GALNT1: β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 1; CCK-8: Cell counting kit-8.

2.3 敲减 B4GALNT1 降低了骨肉瘤细胞的迁移和侵袭

在Saos-2和U2OS细胞中，转染B4GALNT1siRNA的细胞比转染siNC的细胞迁移(均P<0.01，图3A、3B)和侵袭(均P<0.01，图3C、3D)细胞数少。

图3 敲减 B4GALNT1 对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的影响

Figure 3 Effect of B4GALNT1 siRNA on osteosarcoma cell migration and invasion

A and B: Migrated cell number in SaOS-2 (A) and U2OS (B) cells; C and D: Invasion cell number in SaOS-2 (C) and U2OS (D) cells. **P<0.01 vs siNC. B4GALNT1: β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 1.

2.4 敲减 B4GALNT1 抑制了骨肉瘤细胞中EMT和侵袭相关蛋白质的表达

EMT相关蛋白质(N-cadherin、Snail及Vimentin)和侵袭相关蛋白质(MMP9)检测结果表明：与对照组相比，在Saos-2和U2OS细胞中敲减B4GALNT1抑制了N-cadherin、Snail、Vimentin及MMP9的表达(均 P<0.01，图4)。

图4 敲减 B4GALNT1 对骨肉瘤细胞EMT及侵袭相关蛋白质表达的影响

Figure 4 Effect of B4GALNT1 siRNA on the EMT and invasion related proteins in osteosarcoma cells

A: SaOS-2 cells; B: U2OS cells. **P<0.01 vs siNC. B4GALNT1: β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 1; EMT: Epithelial-mesenchymal transition; MMP9: Matrix metallopreteinase 9.

3 讨 论

B4GALNT1在调控神经系统疾病进展中的作用逐渐得到重视[15]。然而，有关其在癌症发生和发展中功能的研究却还不多。据报道，B4GALNT1突变会导致一些系统性疾病的产生，如痉挛性截瘫和1型糖尿病[16-17]，同时，B4GALNT1在多种癌症细胞中表达升高[7-10]，但B4GALNT1在骨肉瘤中的表达还未知。本研究结果表明：与正常组织及hFOB相比，骨肉瘤组织及细胞系中B4GALNT1 mRNA的表达水平升高。这表明B4GALNT1可能与骨肉瘤的发病有关。

B4GALNT1参与神经节苷脂的合成，并在调节细胞生物学功能方面发挥关键作用[10]。据报道，B4GALNT1可通过c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)/c-Jun/Slug途径加速肺腺癌的进展[11]；还可以通过诱导肝细胞癌的EMT促进其转移[12]。在口腔鳞状细胞癌中，B4GALNT1通过p38和JNK-丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途径促进癌细胞的增殖[18]。以上表明B4GALNT1在癌症进展中具有多方面的功能。增殖和转移是癌症发病机制中的重中之重[19]，本研究通过CCK-8及克隆形成实验发现在Saos-2和U2OS细胞中敲减B4GALNT1可以抑制骨肉瘤细胞的增殖，而Transwell相关实验则表明敲减B4GALNT1可以抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭，这些结果均表明下调B4GALNT1可以阻碍骨肉瘤的进展。

EMT参与胚胎发生和DNA修复，并且可以将上皮细胞转变为间充质细胞，从而有利于癌症的进展。EMT还被视为发生转移的常见机制[20]。研究[21]表明：EMT可以影响磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(phosphatidy-linositol-3-kinase-protein kinase B，PI3K/AKT)信号通路、早期2因子(early 2 factor，E2F)和DNA合成后期/分裂期(gap 2 phase/mitosis，G2/M)检查点的调控，而且在癌症治疗干预中具有影响癌症进展的功能。MMP9则是中性粒细胞迁移通过基底膜的调节因子，它可以通过降解和破坏基底膜促进肿瘤细胞向基底膜浸润和侵袭[22]。本研究发现敲减B4GALNT1下调了EMT相关蛋白质N-cadherin、Snail和Vimentin的表达，同时也抑制了侵袭相关蛋白质MMP9的表达，这些结果均表明敲减B4GALNT1抑制了骨肉瘤的EMT和侵袭力，进而限制了骨肉瘤的转移性。

总之，本研究证实B4GALNT1 mRNA在骨肉瘤中高表达，进一步的细胞功能实验证明敲减B4GALNT1削弱了骨肉瘤的恶性表型和EMT。B4GALNT1可能成为治疗骨肉瘤的新的分子靶点，但其具体的分子机制还需要进一步的研究。此外，本研究尚存在一些局限，如所采用的样本均为化疗后的样本，目前还没有相关证据表明化疗会对B4GALNT1的表达及功能产生影响，因此未来可能需要进一步研究化疗是否会影响B4GALNT1在骨肉瘤中的表达及功能。

基金资助

湖南省自然科学基金(2020JJ5799)。This work was supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province, China (2020JJ5799).

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

李帅 研究设计，实验操作，数据分析，论文撰写与修改；王冰、彭丹 论文指导；陈夏、涂超、戴瑜亮 协助实验操作，部分数据分析，论文修改。所有作者阅读并同意最终的文本。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202406870.pdf

http://dx.chinadoi.cn/
==== Refs
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