
==== Front
Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban
Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban
ZJYB
Journal of Zhejiang University (Medical Sciences)
1008-9292
《浙江大学学报》编辑部 杭州市天目山路148号浙江大学西溪校区浙江大学出版社415室

39183055
1008-9292(2024)04-0460-12
10.3724/zdxbyxb-2024-0055
2024-0055
R363.2
R735.7
a
Original Articles
信号识别颗粒14调控肝细胞癌进程并影响患者预后
Expression of signal recognition particle 14 in hepatocellular carcinoma and its relationship with disease progression and patient survivalhttp://orcid.org/0009-0003-1653-6168
田 慧敏 TIAN Huimin 1
唐 冬梅 TANG Dongmei 2
马 美琳 MA Meilin 3
http://orcid.org/0000-0001-9808-3892
傅 湘辉 FU Xianghui 14
1 四川大学华西医院内分泌代谢科 糖尿病与代谢研究室，四川 成都 610041
1 Department of Endocrinology and Metabolism, Center for Diabetes and Metabolism Research, West China Hospital, Sichuan University Chengdu 610041 China
2 四川大学生物治疗协同创新中心，四川 成都 610041
2 Collaborative Innovation Center of Biotherapy, Sichuan University Chengdu 610041 China
3 四川大学华西医院代谢疾病与药物治疗研究所，四川 成都 610041
3 Institute of Metabolic Diseases and Pharmacotherapy, West China Hospital, Sichuan University Chengdu 610041 China
4 四川大学华西医院生物治疗研究中心，四川 成都 610041
4 Department of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University Chengdu 610041 China
余 方
沈 敏
傅湘辉，教授，博士生导师，主要从事重大疾病的共性机制研究；E-mail：xfu@scu.edu.cn；https：//orcid.org/0000-0001-9808-3892
FU Xianghui, E-mail: xfu@scu.edu.cn, https://orcid.org/0000-0001-9808-3892
田慧敏，硕士研究生，主要从事代谢紊乱及癌症等疾病研究；E-mail：tianhmsky@163.com；https：//orcid.org/0009-0003-1653-6168

25 8 2024
53 4 294 460471
22 2 2024
23 6 2024
2024
The Author(s)
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)
目的

探究信号识别颗粒14（SRP14）在肝细胞癌（HCC）中的表达及功能。

方法

利用生物信息学、定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、免疫组织化学染色和蛋白质印迹法等明确SRP14在HCC中的表达；应用Kaplan-Meier法分析SRP14 mRNA表达变化与HCC患者的总生存期、无进展生存期及疾病特异性生存期的相关性；通过5-乙基-2 ´ -94脱氧尿苷（EdU）染色、MTS实验、Transwell小室实验及细胞划痕实验等探索SRP14对HCC细胞增殖和迁移的作用；利用京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体（GO）富集分析以及qRT-PCR初探SRP14在HCC中的作用机制。

结果

在GSE14520数据集、TNMplot数据库和临床标本中，与配对癌旁组织、非配对癌旁组织或正常组织比较，HCC组织的SPR14 mRNA表达均有不同程度的升高（均P<0.05）。在临床标本中，与配对癌旁组织比较，HCC组织的SPR14蛋白表达上调（P<0.05）。SRP14表达上调的HCC患者具有更长的总生存期、无进展生存期及疾病特异性生存期（均P<0.05）。细胞实验结果显示，SRP14能抑制HCC细胞的体外增殖和迁移。KEGG和GO富集分析结果显示，在HCC中，与SRP14共表达的基因主要调控蛋白质合成、加工和运输等相关细胞活动或功能；在非酒精性脂肪性肝病相关HCC中，与SRP14共表达的基因主要调控MAPK、cAMP、PI3K-Akt、Wnt等多条信号传导通路。SRP14抑制HCC细胞中已知抑癌基因GPRC5A的mRNA表达（P<0.05）。

结论

SRP14可能调控HCC进程并影响患者预后。

Objective

To investigate the expression of signal recognition particle 14 (SRP14) in hepatocellular carcinoma (HCC) and its clinical significance.

Methods

The data of SRP14 expression in HCC were obtained from bioinformatics study, and from investigation with quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR), immunohistochemical staining and Western blotting in clinical samples. The Kaplan-Meier analysis was used to determine the associations between SRP14 mRNA expression and the overall survival, progression-free survival, and disease-specific survival of HCC patients. The effect of SRP14 on the proliferation and migration of HCC cells were determined by EdU staining, MTS, Transwell and wound-healing assays. The potential mechanism for SRP14 regulating HCC was explored through Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) and Gene Ontology (GO) enrichment analysis as well as qRT-PCR.

Results

According to the data from GSE14520, TNMplot database and clinical samples, compared with paired tumor-adjacent tissues, non-paired tumor-adjacent tissues and normal tissues, the mRNA expression of SPR14 in HCC tissues was upregulated (all P<0.05). In clinical samples, compared with paired tumor-adjacent tissues, the protein expression of SPR14 in HCC tissues was increased (P<0.05). The increased mRNA expression of SRP14 was associated with good overall survival, progression-free survival, and disease-specific survival in HCC patients. SRP14 inhibited the proliferation and migration of HCC cells in vitro. According to the KEGG and GO enrichment analysis, in non-specific HCC, the genes co-expressed with SRP14 may predominantly regulate protein synthesis, processing, and transport, while in nonalcoholic fatty liver disease related HCC, the genes co-expressed with SRP14 could control multiple signaling pathways such as MAPK, cAMP, PI3K-Akt, and Wnt. Mechanistically, SRP14 up-regulated the mRNA expression of tumor suppressor gene GPRC5A inHCC cells (P<0.05).

Conclusion

SRP14 may regulate HCC progression and influence patient prognosis.

肝细胞癌
非酒精性脂肪性肝病
信号识别颗粒14
G蛋白偶联受体C类组5成员A
细胞增殖
细胞迁移
预后
Hepatocellular carcinoma
Nonalcoholic fatty liver disease
Signal recognition particle 14
G protein-coupled receptor class C group 5 member A
Cell proliferation
Cell migration
Prognosis
四川大学华西医院学科卓越发展1·3·5工程项目ZYGD23005
==== Body
pmc原发性肝癌是一种常见的高致死性肿瘤，每年约有100万新发病例及90万死亡病例，是造成癌症相关死亡的第三大原因［1-2］。HCC是最常见的原发性肝癌［1-2］。HCC的发病背景复杂，危险因素多样，肝炎病毒感染引起的慢性肝病、酒精相关性肝病以及NAFLD均可能导致HCC的发生［3-5］。HCC发生发展是一个复杂的多步骤过程，已有证据提示基因变异、信号传导异常、细胞微环境改变、免疫失调、代谢紊乱等多种机制参与HCC进程［6］。目前，调控HCC发生发展的分子机制及靶点仍不完全清楚。

研究表明，许多分泌蛋白和膜蛋白的表达、定位或功能的变化可能参与调控HCC等多种癌症的进程［7-8］。SRP14作为一种RNA结合蛋白，是哺乳动物细胞内SRP的Alu-结构域组分之一，可与RNA结合并协助核糖体翻译合成的蛋白定位至内质网，从而调控分泌蛋白和膜蛋白在细胞内的表达、定位和功能［9-11］。目前有研究指出，SRP14在血液系统肿瘤［12］、子宫内膜异位症［13］、囊性纤维化［14］及乳腺癌［15］等疾病中异常表达，并可能调控疾病进程。本研究旨在探究SRP14在HCC中的表达变化及与患者预后的关系，并初步探索其对HCC进程的可能影响，以期为HCC的分子靶点确认和机制研究提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

HCC组织及癌旁组织的临床标本均取自在四川大学华西医院进行外科手术治疗的HCC患者。研究开始前已取得所有患者的知情同意。本研究涉及人体组织的操作均遵循赫尔辛基宣言准则并通过四川大学华西医院伦理委员会审查（2022，NO. 1040）。

肝癌细胞系SK-Hep1和SMMC-7721分别来源于北京北纳创联生物技术研究院和中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；HEK-293T细胞来源于美国ATCC细胞库。DMEM培养基、胎牛血清及青-链霉素为美国Gibco公司产品；TRIzol试剂为美国Molecular Research Center公司产品；HiScript® Ⅱ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）和ChamQ SYBR qPCR Master Mix为南京诺唯赞生物科技有限公司产品；RIPA缓冲液、4%多聚甲醛为美国Thermo Fisher公司产品；蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂为美国Selleck公司产品；β-肌动蛋白抗体（β-actin，Cat. No. 20536-1-AP）和SRP14（Cat. No. 11528-1-AP）抗体为美国Proteintech公司产品；苏木素染色液为上海碧云天生物技术有限公司产品；TritonTM X-100为美国Merck公司产品；pLKO.1-TRC慢病毒质粒为美国Addgene公司产品；pCDH-CMV-MCS质粒为美国System Biosciences公司产品；限制性核酸内切酶BamH1、Xba1为美国New England Biolabs公司产品；EdU Apollo567体外检测试剂盒为广州锐博生物技术有限公司产品；防淬灭封片剂为美国Vector Laboratories公司产品；MTS检测试剂盒（CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay）为美国Promega公司产品；Transwell小室为美国Corning公司产品；高保真PCR酶（TransStart® FastPfu Fly DNA Polymerase）为北京全式金生物技术股份有限公司产品；PCR产物回收试剂盒为美国Omega公司产品。荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。克隆引物及其他寡核苷酸序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 生物信息学方法分析HCC组织中SRP14 mRNA的表达及与SRP14共表达的分子

在GEO数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下载HCC的基因mRNA表达水平数据集GSE14520并导入R4.2.1软件，获得HCC和配对癌旁组织中SRP14 mRNA相对表达水平。在TNMplot网站（https：//tnmplot.com/analysis）的RNA-seq数据库中查找并下载HCC组织、配对癌旁组织，以及非配对的正常或癌旁组织中的SRP14 mRNA相对表达水平。

利用TNMplot网站的“关联性分析”（Correlation analysis）功能，获得在HCC（不区分病因）组织中与SRP14共表达的基因（Spearman相关系数 ≥ 0.1且P ≤ 0.05）；生物信息学分析NAFLD相关HCC的数据集GSE214432［16］，获得NAFLD相关HCC中与SRP14共表达的基因，并通过文献检索确定基因的功能（促癌、抑癌或未知功能）；使用TNMplot网站的“功能分析”（Functional analysis）功能，对上述共表达基因进行KEGG和GO富集分析，筛选出前三十个富集基因数最多且P ≤ 0.05的KEGG、GO分子功能和GO生物学过程的数据集，导入GraphPad Prism 10.0软件并作图。

1.3 qRT-PCR检测患者HCC组织中SRP14 mRNA表达

使用TRIzol试剂提取5例患者的HCC及其配对癌旁组织的总RNA，并检测其浓度和纯度。根据说明书使用HiScript® Ⅱ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）试剂盒去除gDNA并将总RNA逆转录为cDNA。稀释cDNA，使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix在荧光定量PCR仪器上对cDNA进行qRT-PCR，qPCR引物序列见表1。导出数据，以β-actin为内参，计算SRP14 mRNA相对表达水平。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基 因	方 法	序列（5 ´ →3 ´ ）	
β-actin	qRT-PCR	正向：CATCCGCAAAGACCTGTACG

反向：CCTGCTTGCTGATCCACATC

	
SRP14	qRT-PCR	正向：AAGTATGACGGTCGAACCAAAC

反向：TCGGTAGCTCTTAACAGACACT

	
SRP14编码序列-酶

切位点

	PCR	正向：CGCGGATCCATGGTGTTGTTGGAGAGCGA

反向：CTAGTCTAGAGAAATGTATGCCCTTTACTG

TGC

	
GPRC5A	qRT-PCR	正向：CTTCCTGACTTTGACCGCAG

反向：ATAGGGGGCATAGAGCGTGT

	
RND3	qRT-PCR	正向：AAAATGCTCTTGGTCGGCTG

反向：TCCGACTGTAAAGCTGAGCA

	
PPP1R15A	qRT-PCR	正向：CTGCCCCTCCGACTGCAAA

反向：GAGCAAGCTGCTCCCAGG

	
INTS6	qRT-PCR	正向：ACTCAAGCACAGCCAGATCT

反向：AACTGGCTGGAGAAGATGCT

	
actin：肌动蛋白；PCR：聚合酶链反应；qRT-PCR：定量逆转录PCR；SRP：信号识别颗粒；GPRC5A：G蛋白偶联受体C类组5成员A；RND：Rho家族GTP酶；PPP1R15A：蛋白磷酸酶1调节亚基15A；INST：整合器复合物亚单位.

1.4 蛋白质印迹法检测患者HCC组织中SRP14蛋白表达

将HCC及其配对癌旁组织从液氮取出，取黄豆粒大小组织块，液氮研磨至粉末后，超声仪充分破碎组织粉末，冰浴条件下，RIPA裂解液充分裂解组织粉末，离心后所得上清液即为组织总蛋白。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度并定量，加热法使总蛋白变性，置于－20 ℃保存。配制合适浓度的SDS聚丙烯酰胺凝胶，取适量的总蛋白样品加样至凝胶的胶孔中，80 V电压条件下，电泳变性后的总蛋白样品；将凝胶转移至PVDF膜上，冰浴条件下，恒定200 mA电流电转约1.5 h；室温条件下，5%脱脂牛奶摇床封闭PVDF膜约1 h；一抗4 ℃孵育过夜；次日，二抗室温摇床孵育2 h；在凝胶成像仪上，使用化学发光法显影条带并采集图像。采用Image J软件处理图像，以β-actin为参照定量分析SRP14蛋白的丰度。

1.5 IHC法检测患者HCC组织中SRP14蛋白表达

将新鲜的HCC组织和癌旁组织切取约5 mm×5 mm大小，再投至中性福尔马林溶液中固定。修剪固定好的组织，置于作好标记的包埋盒中，自来水冲洗过夜，其后依次进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡浸透、石蜡包埋、切片、42 ℃漂片、65 ℃摊片等步骤制作石蜡切片。制作IHC切片：将上述石蜡切片脱蜡、水化，进行抗原修复；3%过氧化氢孵育30 min，5%山羊血清封闭30 min；SRP14一抗4 ℃孵育切片过夜；次日，二抗室温孵育切片2 h；辣根过氧化物酶标记连接物37 ℃孵育切片30 min；DAB工作液显色；苏木素复染2~3 min；脱水、透明、封片；分别在10倍和40倍显微镜物镜下观察组织切片染色结果，SRP14蛋白呈棕褐色，采集图像。Image J软件处理组织IHC切片图像，利用IHC Profiler插件对SRP14蛋白的丰度进行定量评价和评分，将低阳性、阳性和高阳性评分相加的结果记为SRP14蛋白阳性评分。

1.6 Kaplan-Meier生存曲线分析SRP14表达与HCC患者预后的关系

进入Kaplan-Meier Plotter网站（https：//kmplot.com/analysis/index.php？p=service）［17］，选中mRNA RNA-seq数据库中的“Liver cancer”选项，基因名输入SRP14，分析比较SRP14高表达和低表达HCC患者的总生存期（高表达组n = 268，低表达组n = 96）、无进展生存期（高表达组n=277，低表达组n = 93）和疾病特异性生存期（高表达组n = 269，低表达组n = 93）。总生存期指从随机化分组开始至出现全因死亡的时间，无进展生存期指从随机化分组开始至出现HCC进展或全因死亡的时间，疾病特异性生存期指从随机化分组开始至出现由HCC导致死亡的时间。

1.7 构建敲低和过表达SRP14的HCC细胞稳株

使用高保真PCR酶将SRP14短发夹RNA及其对照序列克隆至pLKO.1-TRC慢病毒质粒上，构建表达靶向SRP14的短发夹RNA的质粒（sh-SRP14）和对照质粒。高保真PCR酶克隆SRP14的编码序列（表1），回收克隆产物，酶切连接法将SRP14的编码序列插入到pCDH-CMV-MCS质粒上，构建SRP14过表达质粒，以pCDH-CMV-MCS空载为对照质粒。利用Attractene转染试剂将上述目的质粒或对照质粒与包装质粒共转染到HEK-293T细胞中，48 h后收集细胞上清并离心获得慢病毒颗粒。慢病毒颗粒感染SK-Hep1细胞和SMMC-7721细胞，嘌呤霉素筛选阳性细胞，构建敲低和过表达SRP14的HCC细胞稳株。蛋白质印迹法检测上述细胞稳株SRP14的表达水平，验证SRP14敲低和过表达效果。

1.8 EdU染色检测HCC细胞体外增殖情况

敲低或过表达SRP14的SK-Hep1细胞和SMMC-7721细胞及各自对照细胞稳株在24孔板细胞爬片上培养，待细胞生长状态良好、生长至50%~60%时，用含50 μmol/L EdU的培养基孵育细胞2 h。室温条件下，4%多聚甲醛固定细胞20 min，甘氨酸孵育5 min，含0.5% TritonX-100的PBS渗透剂孵育10 min。室温避光条件下，Apollo染色反应液孵育细胞30 min，含0.5% TritonTM X-100的PBS渗透剂摇床清洗两三次，每次10 min；Hoechst反应液孵育细胞30 min。防淬灭封片剂封闭爬片，立即在荧光显微镜下观察荧光染色情况，S期细胞可被EdU特异性染色而呈红色，所有细胞的细胞核可被Hoechst染色而呈蓝色，采集图片。

1.9 MTS细胞增殖实验检测HCC细胞体外增殖情况

敲低或过表达SRP14的SK-Hep1细胞和SMMC-7721细胞及各自对照细胞稳株均匀培养在同一96孔板中，待细胞生长状态良好，按照MTS检测试剂盒说明书，分别在0、24、48和72 h时加入适量MTS试剂，细胞培养箱中孵育1 h。使用酶标仪检测96孔板中490 nm处的吸光度，记录数值。

1.10 Transwell小室实验检测HCC细胞体外迁移能力

敲低或过表达SRP14的SK-Hep1细胞和SMMC-7721细胞及各自对照细胞稳株在不含胎牛血清的Transwell顶部小室中培养，并控制各组的细胞密度基本一致。待细胞生长状态良好，Transwell底部小室添加含10%胎牛血清的培养基，24 h后将穿透至底部小室的细胞固定、结晶紫染色，在显微镜下观察染色情况和采集图像。使用Image J软件处理图像并对穿透在底部小室的细胞进行定量分析。

1.11 细胞划痕实验检测HCC细胞体外迁移能力

敲低或过表达SRP14的SMMC-7721细胞及对照细胞稳株培养在六孔板中，保证各组细胞密度基本一致且生长状态良好，待细胞生长融合为单层细胞时，用移液管尖端均匀划伤单层细胞造成一致划痕，显微镜下观察细胞划痕并采集图像；继续培养细胞48 h后，显微镜下再观察此时的细胞划痕和迁移区域并采集图像。使用Image J软件处理图像并对划痕愈合面积进行定量分析。

1.12 qRT-PCR检测HCC细胞中GPRC5A、RND3、PPPR1R15A、INST6 mRNA表达

使用TRIzol试剂提取敲低或过表达SRP14的SK-Hep1细胞及SMMC-7721细胞的总RNA，并检测其浓度和纯度。根据说明书使用HiScript® Ⅱ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）试剂盒去除gDNA并将总RNA逆转录为cDNA。稀释cDNA，使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix在荧光定量PCR仪器上对cDNA进行qRT-PCR，qPCR引物序列见表1。导出数据，以β-actin为内参，计算GPRC5A、RND3、PPPR1R15A及INST6 mRNA的相对表达量。

1.13 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。实验数据来自至少三次独立实验，其中正态分布数据以均值 ± 标准差（ x¯ ±s）描述，非正态分布数据以中位数（上下四分位数）［M（Q 1，Q 3）］描述，通过非配对或配对的双尾t检验或单因素方差分析进行检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC组织中SRP14的mRNA及蛋白表达增高

GSE14520数据集分析结果显示，相比配对癌旁组织，HCC组织中的SPR14 mRNA相对表达水平升高（P < 0.01）。同样，TNMplot的RNA-seq数据库结果显示，相比配对癌旁组织、非配对癌旁组织或正常组织，HCC组织中的SPR14 mRNA相对表达水平均升高（均P<0.01）。qRT-PCR检测结果显示，相比配对癌旁组织，患者HCC组织中的SPR14 mRNA相对表达水平升高（P<0.05）。见表2。结果提示HCC组织中SRP14 mRNA表达水平升高。

表2 HCC组织及癌旁/正常组织中SRP14 mRNA水平比较

Table 2 The mRNA expression of SRP14 in HCC and non-tumor tissues

数据来源	n	癌旁/正常组织	HCC组织	
GSE14520	241	－0.54（－0.88，－0.22）	0.68（0.24，1.07）**	
TNMplot（配对）	50	1945.00±741.40	3213.00±1545.00**	
TNMplot（不配对）#	371	1742.00±750.40	3806.00±2088.00**	
临床HCC组织	5	0.14±0.08	0.29±0.11*	
与癌旁/正常组织比较，* P < 0.05，** P < 0.01. #癌旁/正常组织n=175. HCC：肝细胞癌；SRP：信号识别颗粒；mRNA：信使RNA.

M（Q 1，Q 3）或 x¯ ±s

蛋白质印迹法检测结果显示，相比配对癌旁组织，HCC组织的SRP14蛋白表达增高约0.55倍（P < 0.05），见图1。IHC结果同样证实，配对癌旁组织中的SRP14蛋白丰度评分为11.1±2.4，而在HCC组织中的SRP14蛋白丰度评分则为21.4±5.8，显著高于癌旁组织（P < 0.01），见图2。提示HCC组织中SRP14蛋白表达水平升高。

图1 临床肝细胞癌组织和配对癌旁组织SRP14蛋白质电泳图

Figure 1 Electrophoretogram of SRP14 protein in hepatocellular carcinoma and paired tumor-adjacent tissues

NT：癌旁组织；T：肝细胞癌组织；SRP：信号识别颗粒；actin：肌动蛋白.

图2 临床HCC组织和配对癌旁组织SRP14蛋白免疫组织化学染色结果

Figure 2 SRP14 protein in HCC and paired tumor-adjacent tissues observed by immunohisto-chemistry

蓝紫色代表细胞核，棕褐色代表SRP14蛋白. 与癌旁组织比较，HCC组织中SRP14蛋白更为丰富. HCC：肝细胞癌；SRP：信号识别颗粒.

2.2 SRP14高表达与HCC患者的良好预后呈正相关

Kaplan-Meier生存分析结果显示，HCC组织低表达SRP14的患者中位总生存期和中位无进展生存期分别为36.3和18.3个月，疾病特异性生存期的上四分位数为19.4个月；而HCC组织高表达SRP14的患者中位总生存期、中位无进展生存期分别为70.5和25.9个月，疾病特异性生存期的上四分位数为45.7个月，见图3。可见SRP14高表达的HCC患者具有更长总生存期、无进展生存期和疾病特异性生存期［HR=0.49（0.34~0.70）、HR=0.70（0.51~0.97）和HR=0.42（0.26~0.65），均P<0.05］，即SRP14在HCC组织中的表达升高与HCC患者的良好预后呈正相关。

图3 SRP14高表达和低表达肝细胞癌患者的Kaplan-Meier生存曲线

Figure 3 Kaplan-Meier survival curves of hepatocellular carcinoma patients with different SRP14 mRNA levels

SRP：信号识别颗粒.

2.3 SPR14抑制HCC细胞体外增殖

构建SRP14敲低和过表达的SK-Hep1细胞和SMMC-7721细胞稳株（图4）。EdU染色结果显示，相同条件下，敲低SPR14的SK-Hep1细胞和SMMC-7721细胞的S期荧光细胞比例明显多于相应对照，过表达SRP14则相反（图5）。同样地，MTS实验结果显示，48、72 h时敲低SPR14的SK-Hep1细胞和SMMC-7721细胞在490 nm处的吸光度值均明显大于相应对照，过表达SRP14则相反（图6）。提示SRP14可抑制HCC细胞的体外增殖。

图4 SK-Hep1细胞和SMMC-7721细胞稳株中敲低或过表达SRP14的蛋白质电泳图

Figure 4 Electrophoretogram of SRP14 protein in the SK-Hep1 and SMMC-7721 with knockdown or overexpression of SRP14

SRP：信号识别颗粒；actin：肌动蛋白.

图5 肝癌细胞敲低或过表达SRP14后EdU染色结果

Figure 5 EdU staining pictures of hepatocellular carcinoma cells with knockdown or overexpression of SRP14

细胞周期S期的细胞（代表增殖期细胞）被EdU特异性荧光标记呈红色，细胞核被Hoechst特异性染色呈蓝色. 敲低SRP14的SK-Hep1细胞和SMMC-7721细胞的红色S期荧光细胞比例较相应对照更高，过表达SRP14细胞则相反. 标尺=100 μm. SRP：信号识别颗粒；EdU：5-乙基-2'-94脱氧尿苷.

图6 肝细胞癌细胞敲低或过表达SRP14后体外生长曲线（MTS实验）

Figure 6 In vitro growth curves of hepatocellular carcinoma cells with knockdown or overexpression of SRP14 （MTS assay）

与相应对照比较，*P<0.05，**P<0.01. SRP：信号识别颗粒；MTS：3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑.

2.4 SPR14抑制HCC细胞的体外迁移

Transwell小室实验结果显示，敲低SRP14的SK-Hep1细胞和SMMC-7721细胞在24 h时迁移至底部小室较相应对照多，过表达SRP14则相反，见图7、表3。细胞划痕实验结果显示，敲低SRP14的SMMC-7721细胞在48 h时划痕愈合面积较相应对照大，过表达SRP14则相反，见图8、表3。提示SRP14可抑制HCC细胞的体外迁移。

图7 各组肝细胞癌细胞敲低或过表达SRP14后的体外迁移能力比较（Transwell小室实验）

Figure 7 In vitro migration of hepatocellular carcinoma cells with knockdown or overexpression of SRP14 （Transwell assay）

与相应对照比较，敲低SRP14的SK-Hep1细胞和SMMC-7721细胞穿透至小室底部较多，而过表达SRP14的SK-Hep1细胞和SMMC-7721细胞穿透至小室底部较少. 标尺=100 μm. SRP：信号识别颗粒.

表3 各组肝细胞癌细胞迁移数和划痕愈合面积比较

Table 3 Migration numbers or wound closure proportion of hepatocellular carcinoma cells with knockdown or overexpression of SRP14

组 别	迁移数	愈合面积（%）	
SK-Hep1细胞	SMMC-7721细胞	
敲低对照	60±6	39±3	35.0±4.9	
敲低SRP14	113±21*	121±18**	55.6±2.6**	
过表达对照	59±10	53±4	40.5±2.8	
过表达SRP14	34±3*	14±3**	22.2±0.9**	
与相应对照比较，* P < 0.05，** P < 0.01. SRP：信号识别颗粒.

x¯ ±s，n=3

图8 各组肝细胞癌细胞敲低或过表达SRP14后体外迁移能力比较（细胞划痕实验）

Figure 8 In vitro migration of hepatocellular carcinoma cells with knockdown or overexpression of SRP14 （Wound-healing assay）

与相应对照比较，敲低SRP14的SMMC-7721细胞48 h时划痕愈合面积增大，而过表达SRP14的SMMC-7721细胞的划痕愈合面积则减小. 标尺=200 μm. SRP：信号识别颗粒.

2.5 SPR14调控HCC的潜在分子机制

对HCC（不区分病因）与SRP14共表达的2820个基因进行KEGG和GO富集分析。结果显示，KEGG分析富集到细胞周期、肌动骨架调节、紧密连接等细胞增殖和迁移相关的通路；与此一致，GO分析富集到细胞周期调节、钙黏着蛋白结合及微管蛋白结合等细胞增殖和迁移相关的分子。提示与SRP14共表达的分子可能调控HCC细胞增殖和迁移。此外，KEGG和GO分析还富集到大量参与RNA结合、核糖体结合、mRNA加工、内质网中的蛋白质加工、蛋白质定位及转运等过程的分子，表明与SRP14共表达分子可能具有RNA加工、核糖体翻译、蛋白质加工和运输等功能。见附图1A~C。这些共表达分子的功能与SRP的功能相似，提示SRP14可能是通过SRP途径来调控HCC细胞的蛋白合成、加工或运输等，从而实现其在HCC中的功能。

对NAFLD相关HCC（GSE214432数据集）与SRP14共表达的627个基因进行KEGG富集分析。结果显示，与前面的富集分析结果比较，GSE214432数据集中与SRP14共表达的基因的功能及参与通路等存在明显差异，其中排名前三十的KEGG通路涉及MAPK信号通路、cAMP信号通路、PI3K-Akt信号通路、Wnt信号通路等（附图1D），而在之前的富集分析中并未涉及上述信号通路，提示在不同病因导致的HCC中，SRP14可能具有不同的作用和机制。为进一步探索SRP14的下游靶点，对GSE214432数据集中与SRP14共表达相关系数最高的前十五个基因（ZNF799、PALM3、DGCR9、ZNF700、GPRC5A、RND3、KRT27、RASL11B、PPP1R15A、MC1R、SLC35D3、ZNF493、INTS6、RANBP2、ZNF555）进行了相关文献查阅，筛选出4个HCC抑癌基因——GPRC5A ［18］ 、RND3 ［19-21］ 、PPP1R15A ［22］和INTS6 ［23］。qRT-PCR检测结果显示，在SK-Hep1细胞和SMMC-7721细胞中，敲低SRP14能抑制GPRC5A的mRNA表达，过表达SRP14则能促进GPRC5A的mRNA表达，与生信分析结果相符；而SRP14表达变化对RND3、PPP1R15A和INTS6的mRNA表达则无明确影响。见表4。综上提示，GPRC5A可能是SRP14的潜在下游作用靶点。

表4 敲低和过表达SRP14后肝细胞癌细胞中GPRC5A、RND3、PPP1R15A、INTS6 mRNA表达

Table 4 The mRNA expression of GPRC5A， RND3， PPP1R15A and INTS6 in hepatocellular carcinoma cells with knockdown or overexpression of SRP14

组 别	GPRC5A	RND3	PPP1R15A	INST6	
SK-Hep1细胞					
敲低对照	1.000±0.092	1.000±0.096	1.000±0.149	1.000±0.207	
敲低SRP14	0.688±0.107*	0.835±0.190	0.731±0.090	0.859±0.177	
过表达对照	1.000±0.131	1.000±0.145	1.000±0.134	1.000±0.135	
过表达SRP14	2.162±0.263**	1.858±0.677	4.295±0.618**	0.632±0.116*	
SMMC-7721细胞					
敲低对照	1.000±0.179	1.000±0.200	1.000±0.257	1.000±0.135	
敲低SRP14	0.458±0.026**	0.959±0.220	0.566±0.115	0.955±0.147	
过表达对照	1.000±0.100	1.000±0.033	1.000±0.275	1.000±0.175	
过表达SRP14	1.397±0.092**	1.084±0.271	1.311±0.111	0.819±0.171	
与相应对照比较，* P < 0.05，** P < 0.01. SRP：信号识别颗粒；GPRC5A：G蛋白偶联受体C类组5成员A；RND：Rho家族GTP酶；PPP1R15A：蛋白磷酸酶1调节亚基15A；INST：整合器复合物亚单位.

x¯ ±s，n=3

3 讨论

HCC是一种高发病率、高致死率的癌症，严重危害着患者的健康和生命。更为重要的是，由于导致HCC发生发展的分子靶点和机制仍不清楚，目前能有效治疗HCC的药物仍十分匮乏，严重影响着HCC患者特别是进展期HCC患者的治疗效果和预后。

分泌蛋白和膜蛋白的正常表达和定位是生命活动正常进行所必需的［24］，其异常广泛参与代谢性疾病、癌症等多种疾病的进程［25］。如NAFLD进展至HCC的过程中，许多分泌蛋白或膜蛋白发生变化［4-5， 26-30］，并与代谢紊乱等促癌因素相互作用，促进疾病进程［4， 31］。SRP14是调控分泌蛋白表达和定位的重要分子［9-11］。本研究首先利用生物信息学分析、qRT-PCR、IHC及蛋白质印迹法等明确了SRP14在HCC中表达升高；随后，通过Kaplan-Meier生存分析揭示了SRP14高表达与HCC患者良好预后正相关；接着，利用EdU染色、MTS、Transwell小室及细胞划痕实验等初步发现了SRP14可抑制HCC细胞的体外增殖和迁移；最后，基于本研究发现的SRP14抑癌功能，结合NAFLD正日益成为HCC重要来源的流行病学数据［2， 4-5］，应用KEGG和GO分析结合qRT-PCR探究了NAFLD相关HCC中SRP14抑癌的可能分子机制，初步发现SRP14可促进已知HCC抑癌基因GPRC5A的mRNA表达。这些结果最终提示SRP14在HCC中上调并发挥抑癌作用及改善患者预后，为探究HCC发生发展的机制和开发靶向治疗药物提供了新线索。

对于本研究中SRP14在HCC中的表达与功能较矛盾的结果，笔者认为可能是以下两个原因导致的：首先，同一分子在不同病因的HCC中可能具有不同的表达变化和功能［32］，SRP14在不同病因的HCC中的表达、功能以及对预后的影响可能不完全一致。根据本研究的初步结果，后续可深入研究SRP14在NAFLD相关HCC中的表达、功能及对患者预后的影响，从而明确SRP14的表达或功能是否与HCC的病因有关。其次，既往研究表明，SRP14的促癌功能与肿瘤微环境、免疫细胞的作用或细胞分化等有关［12， 15， 33］，而本研究主要探讨了SRP14对肿瘤细胞本身的作用，并未涉及肿瘤微环境和免疫细胞等方面。考虑到在不同阶段或不同病因的HCC中，肿瘤细胞本身、肿瘤微环境或免疫细胞浸润等常具有明显的异质性，推测SRP14可能在HCC中发挥多样而复杂的功能。

基于本研究的发现，推断SRP14可能参与调控HCC的进程，其中GPRC5A可能作为SRP14下游作用靶点参与NAFLD相关HCC的调控。但是，本研究的结果还有很多方面值得深入探究。首先，SRP14在HCC中的表达调控机制并不清楚；其次，SRP14抑制HCC的作用尚需在动物模型中验证；再者，GPRC5A是否真正介导了SRP14抑制HCC的功能，以及SRP14调控HCC生长和转移的具体分子机制尚不明晰。后续研究可从以下方面深入：①构建SRP14基因敲除或过表达的HCC小鼠模型，并检测SRP14表达变化对小鼠HCC进程和预后的影响；②通过RNA-seq或蛋白质组学等技术，检测敲低SRP14对HCC细胞或HCC组织中RNA和蛋白表达的影响，并结合分子实验、细胞实验及动物实验等手段进一步筛选和明确SRP14在HCC中的作用靶点和机制；③继续明确SRP14发挥抑制HCC的功能是否依赖于GPRC5A及相关通路等；④有研究表明GPRC5A可通过在内质网抑制具有促癌作用的分泌蛋白和膜蛋白表达等方式发挥抑癌作用［34］，基于此以及考虑到SRP14在分泌蛋白和膜蛋白的表达和定位中的功能，后续还可通过解析HCC进程中分泌蛋白或膜蛋白的时空特异性图谱，以帮助确定SRP4调控HCC进程的具体机制。

Supplementary information

本文附图见电子版。

研究得到四川大学华西医院学科卓越发展1·3·5工程项目（ZYGD23005）的支持. 感谢所有临床标本的捐赠者

This work was supported by the 1·3·5 Project for Disciplines of Excellence, West China Hospital, Sichuan University (ZYGD23005). We thank all the donors for donating clinical samples

利益冲突声明

所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of Interests

The authors declare that there is no conflict of interests

［缩略语］

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）；非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）；信号识别颗粒（signal recognition particle，SRP）；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）；定量PCR（quantitative PCR，qPCR）；基因组DNA（genomic DNA，gDNA）；5-乙基-2'-94脱氧尿苷（5-ethyl-2'-94 deoxyuridine，EdU）；3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium，MTS］；基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）；信使RNA（messenger RNA，mRNA）；RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）；京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）；基因本体（Gene Ontology，GO）；定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）；互补DNA（complementary DNA，cDNA）；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）；免疫组织化学染色（immunohistochemical staining，IHC）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）；G蛋白偶联受体C类组5成员A（G protein-coupled receptor class C group 5 member A，GPRC5A）；Rho家族GTP酶（Rho family GTPase，RND）；蛋白磷酸酶1调节亚基15A（protein phosphatase 1 regulatory subunit 15A，PPP1R15A）；整合器复合物亚单位（integrator complex subunit，INST）；风险比（hazard ratio，HR）
==== Refs
参考文献（References）

1 LLOVET J M , KELLEY R K , VILLANUEVA A , Hepatocellular carcinoma[J]. Nat Rev Dis Primers, 2021, 7 (1 ): 6. 10.1038/s41572-020-00240-3 33479224
2 SINGAL A G , KANWAL F , LLOVET J M . Global trends in hepatocellular carcinoma epidemiology: impli-cations for screening, prevention and therapy[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2023, 20 (12 ): 864-884. 10.1038/s41571-023-00825-3 37884736
3 ANSTEE Q M , REEVES H L , KOTSILITI E , From NASH to HCC: current concepts and future chal-lenges[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2019, 16 (7 ): 411-428. 10.1038/s41575-019-0145-7 31028350
4 HUANG D Q , EL-SERAG H B , LOOMBA R . Global epidemiology of NAFLD-related HCC: trends, predic-tions, risk factors and prevention[J]. Nat Rev Gastro-enterol Hepatol, 2021, 18 (4 ): 223-238. 10.1038/s41575-020-00381-6
5 NORERO B , DUFOUR J F . Should we undertake sur-veillance for HCC in patients with MAFLD?[J]. Ther Adv Endocrinol Metab, 2023, 14 : 20420188231160389. 10.1177/20420188231160389 37006779
6 LLOVET J M , PINYOL R , KELLEY R K , Molecular pathogenesis and systemic therapies for hepatocellular carcinoma[J]. Nat Cancer, 2022, 3 (4 ): 386-401. 10.1038/s43018-022-00357-2 35484418
7 WANG T , ZHOU Y , ZHOU Z , Secreted protease PRSS35 suppresses hepatocellular carcinoma by dis-abling CXCL2-mediated neutrophil extracellular traps[J]. Nat Commun, 2023, 14 (1 ): 1513. 10.1038/s41467-023-37227-z 36934105
8 HSIAO Y C , CHU L J , CHEN J T , Proteomic profiling of the cancer cell secretome: informing clinical research[J]. Expert Rev Proteomics, 2017, 14 (9 ): 737-756. 10.1080/14789450.2017.1353913 28695748
9 WEICHENRIEDER O , WILD K , STRUB K , Structure and assembly of the Alu domain of the mam-malian signal recognition particle[J]. Nature, 2000, 408 (6809 ): 167-173. 10.1038/35041507 11089964
10 BERGER A , IVANOVA E , GAREAU C , Direct binding of the Alu binding protein dimer SRP9/14 to 40S ribosomal subunits promotes stress granule for-mation and is regulated by Alu RNA[J]. Nucleic Acids Res, 2014, 42 (17 ): 11203-11217. 10.1093/nar/gku822 25200073
11 LIN S , KUANG M . RNA modification-mediated mRNA translation regulation in liver cancer: mechanisms and clinical perspectives[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2024, 21 (4 ): 267-281. 10.1038/s41575-023-00884-y 38243019
12 SHI L , HUANG R , LAI Y . Identification and validation of signal recognition particle 14 as a prognostic biomarker predicting overall survival in patients with acute myeloid leukemia[J]. BMC Med Genomics, 2021, 14 (1 ): 127. 10.1186/S12920-021-00975-2 33985510
13 RAHMIOGLU N , MORTLOCK S , GHIASI M , The genetic basis of endometriosis and comorbidity with other pain and inflammatory conditions[J]. Nat Genet, 2023, 55 (3 ): 423-436.36914876
14 NOWAK J K , SZYMAŃSKA C J , WALKOWIAK J . Differential correlation network analysis of rectal tran-scriptomes reveals cystic fibrosis-related disturbance[J]. Pharmacogenomics, 2022, 23 (6 ): 339-344. 10.2217/pgs-2021-0138 35189732
15 NABET B Y , QIU Y , SHABASON J E , Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer[J]. Cell, 2017, 170 (2 ): 352-366.e13. 10.1016/j.cell.2017.06.031 28709002
16 FUJIWARA N , KUBOTA N , ZHU S , Dissemi-native recurrence signature for hepatocellular carcinoma from nonalcoholic fatty liver disease[J]. Gastro Hep Adv, 2023, 2 (5 ): 681-683. 10.1016/j.gastha.2023.03.021 37621719
17 MENYHÁRT O , NAGY Á , GYŐRFFY B . Determining consistent prognostic biomarkers of overall survival and vascular invasion in hepatocellular carcinoma[J]. R Soc Open Sci, 2018, 5 (12 ): 181006. 10.1098/rsos.181006 30662724
18 ZHANG L , YANG W , YANG J , GPRC5A regu-lates proliferation and oxidative stress by inhibiting the STAT3/Socs3/c-MYC pathway in hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Biochem Nutr, 2023, 73 (1 ): 43-51. 10.3164/jcbn.22-125 37534091
19 MA W , WONG C C , TUNG E K , RhoE is frequently down-regulated in hepatocellular carcinoma (HCC) and suppresses HCC invasion through antago-nizing the Rho/Rho-kinase/myosin phosphatase target pathway[J]. Hepatology, 2013, 57 (1 ): 152-161. 10.1002/hep.25987 22829315
20 GRISE F , SENA S , BIDAUD-MEYNARD A , Rnd3/RhoE is down-regulated in hepatocellular carci-noma and controls cellular invasion[J]. Hepatology, 2012, 55 (6 ): 1766-1775. 10.1002/hep.25568 22234932
21 PAYSAN L , PIQUET L , SALTEL F , Rnd3 in cancer: a review of the evidence for tumor promoter or suppressor[J]. Mol Cancer Res, 2016, 14 (11 ): 1033-1044. 10.1158/1541-7786.mcr-16-0164 27555595
22 GAN G , SHI Z , SHANGGUAN C , The kynurenine derivative 3-HAA sensitizes hepatocellular carcinoma to sorafenib by upregulating phosphatases[J]. Theranostics, 2021, 11 (12 ): 6006-6018. 10.7150/thno.59841 33897895
23 LUI K Y , ZHAO H , QIU C , Integrator complex subunit 6 (INTS6) inhibits hepatocellular carcinoma growth by Wnt pathway and serve as a prognostic marker[J]. BMC Cancer, 2017, 17 (1 ): 644. 10.1186/s12885-017-3628-3 28899352
24 WATT M J , MIOTTO P M , DE NARDO W , The liver as an endocrine organ-linking NAFLD and insulin resistance[J]. Endocr Rev, 2019, 40 (5 ): 1367-1393. 10.1210/er.2019-00034 31098621
25 XIONG X , KUANG H , ANSARI S , Landscape of intercellular crosstalk in healthy and NASH liver revealed by single-cell secretome gene analysis[J]. Mol Cell, 2019, 75 (3 ): 644-660.e5. 10.1016/j.molcel.2019.07.028 31398325
26 LLOVET J M , WILLOUGHBY C E , SINGAL A G , Nonalcoholic steatohepatitis-related hepatocellular carcinoma: pathogenesis and treatment[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2023, 20 (8 ): 487-503. 10.1038/s41575-023-00754-7 36932227
27 YOSHIMOTO S , LOO T M , ATARASHI K , Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome[J]. Nature, 2013, 499 (7456 ): 97-101. 10.1038/nature12347 23803760
28 FUJIWARA N , KUBOTA N , CROUCHET E , Molecular signatures of long-term hepatocellular carci-noma risk in nonalcoholic fatty liver disease[J]. Sci Transl Med, 2022, 14 (650 ): eabo4474. 10.1126/scitranslmed.abo4474 35731891
29 YAMAGISHI R , KAMACHI F , NAKAMURA M , Gasdermin D-mediated release of IL-33 from senescent hepatic stellate cells promotes obesity-associated hepato-cellular carcinoma[J]. Sci Immunol, 2022, 7 (72 ): eabl7209. 10.1126/sciimmunol.abl7209 35749514
30 SEN B , AGGARWAL S , NATH R , Secretome of senescent hepatoma cells modulate immune cell fate by macrophage polarization and neutrophil extracellular traps formation[J]. Med Oncol, 2022, 39 (9 ): 134. 10.1007/s12032-022-01732-w 35726030
31 XU K , WU T , XIA P , Alternative splicing: a bridge connecting NAFLD and HCC[J]. Trends Mol Med, 2023, 29 (10 ): 859-872. 10.1016/j.molmed.2023.07.001 37487782
32 LI L , WANG H . Heterogeneity of liver cancer and personalized therapy[J]. Cancer Lett, 2016, 379 (2 ): 191-197. 10.1016/j.canlet.2015.07.018 26213370
33 LI M , LIU Z , WANG J , Systematic analysis identifies a specific RNA-binding protein-related gene model for prognostication and risk-adjustment in HBV-related hepatocellular carcinoma[J]. Front Genet, 2021, 12 : 707305. 10.3389/fgene.2021.707305 34422009
34 WANG J , FARRIS A B , XU K , GPRC5A sup-presses protein synthesis at the endoplasmic reticulum to prevent radiation-induced lung tumorigenesis[J]. Nat Commun, 2016, 7 : 11795. 10.1038/ncomms11795 27273304
