
==== Front
Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban
Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban
ZJYB
Journal of Zhejiang University (Medical Sciences)
1008-9292
《浙江大学学报》编辑部 杭州市天目山路148号浙江大学西溪校区浙江大学出版社415室

38832464
1008-9292(2024)04-0419-08
10.3724/zdxbyxb-2023-0454
2023-0454
R683
R33
a
Monographic Reports
正弦交变电磁场可加速大鼠骨折愈合
Sinusoidal alternating electromagnetic field accelerates fracture healing in ratshttp://orcid.org/0000-0001-7845-3796
高 玉海 GAO Yuhai 12
侯 雪峰 HOU Xuefeng 1
魏 振龙 WEI Zhenlong 12
http://orcid.org/0000-0002-9749-8356
陈 克明 CHEN Keming 12
1 联勤保障部队第九四○医院基础医学实验室，甘肃 兰州 730050
1 Laboratory of Basic Medical Science Research, the 940th Hospital of Joint Logistics Support Force of PLA Lanzhou 730050 China
2 甘肃省干细胞与基因药物重点实验室，甘肃 兰州 730050
2 Key Laboratory of Stem Cells and Gene Drugs Lanzhou 730050 China
沈 敏
余 方
陈克明，主任技师，教授，硕士生导师，主要从事基础医学研究；E-mail：chenkm@lut.edu.cn；https：//oricd.org/0000-0002-9749-8356
CHEN Keming, E-mail: chenkm@lut.edu.cn, https://oricd.org/0000-0002-9749-8356
高玉海，主管技师，主要从事骨代谢基础研究；E-mail：gyh1389@126.com；https：//oricd.org/0000-0001-7845-3796

25 8 2024
53 4 294 419426
21 9 2023
12 3 2024
2024
The Author(s)
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)
目的

观察正弦交变电磁场（SEMF）对骨折愈合的影响并探讨其作用机制。

方法

30只无特定病原体级雄性Wistar大鼠建立骨折模型后按随机分组法分为模型对照组和SEMF组，每组15只。SEMF组每天给予50 Hz 1.8 mT的SEMF 90 min，模型对照组不做任何处理。每两周进行X线检查判断各组大鼠骨痂形成情况，在电磁场干预后的第二周和第四周各组分别处死3只大鼠并取术侧骨折处骨组织提取蛋白，蛋白质印迹法检测Ⅰ型胶原蛋白（COL-1）、Osterix蛋白（OSX）、Runt相关转录因子2（RUNX2）、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达。8周后取术侧股骨行显微CT扫描观察骨折愈合、行血管造影观察血管生长情况，并取心、肝、脾、肺、肾等器官采用苏木精-伊红染色（HE染色）进行安全性评价。

结果

SEMF组治疗2、4、6、8周后骨痂评分均显著高于模型对照组（均P<0.01）；8周后SEMF组骨折愈合情况优于模型对照组，两组骨体积分数分别为0.243±0.012和0.186±0.008，差异有统计学意义（P<0.01）；8周后SEMF组血管数也均优于模型对照组。蛋白质印迹法结果显示，SEMF组治疗2、4周后COL-1、OSX、RUNX2、VEGF蛋白表达均高于模型对照组（均P<0.05）。HE染色结果显示，SEMF组和模型对照组各器官组织病理学观察均无异常。

结论

SEMF能够通过促进不同时期成骨因子的蛋白表达和血管增生从而加速骨折的愈合，并且无明显不良反应。

Objective

To investigate the effect of sinusoidal alternating electromagnetic field (SEMF) on fracture healing and its mechanism.

Methods

Femoral fracture model was established using specific pathogen free male Wistar rats. Thirty rats were randomly divided into the control and SEMF groups with 15 rats in each group. The SEMF group was given 50 Hz 1.8 mT for 90 min every day, while the control group was not treated. X-ray examinations were performed every two weeks to determine the formation of bone scabs. Three rats from both groups were sacrificed after 2 and 4 weeks of treatment. Protein was extracted from the fractured femurs, and the expression of type Ⅰ collagen (COL-1), osterix (OSX), Runt-related transcription factor 2 (RUNX2), and vascular endothelial growth factor (VEGF) was detected by Western blotting. After 8 weeks, the femur on the operated side was taken for micro-CT scanning to observe fracture healing, angiography to observe blood vessel growth, and organs such as hearts, livers, spleens, lungs, and kidneys were taken for safety evaluation by hematoxylin-eosin staining (HE staining).

Results

The bone scab scores of the SEMF group were significantly higher than those of the control group after 2, 4, 6, and 8 weeks of treatment (all P<0.01). The fracture healing of the SEMF group was better than that of the control group after 8 weeks, and the bone volume scores of the two groups were 0.243±0.012 and 0.186±0.008, respectively (P<0.01); the number of blood vessels in the SEMF group was also more than that of the control group after 8 weeks. Western blotting results showed that the expressions of COL-1, OSX, RUNX2, and VEGF were higher in the SEMF group than those in the control group after 2 and 4 weeks of treatment (all P<0.05). HE staining showed that histopathological results of the examined organs were normal in both groups.

Conclusion

SEMF can accelerate fracture healing by promoting the expression of osteogenic factors and vascular proliferation without significant adverse effects.

正弦交变电磁场
骨形成
血管造影术
骨折愈合
安全性
大鼠
Sinusoidal alternating electromagnetic field
Bone formation
Angiography
Fracture healing
Safety
Rats
军队后勤自主科研项目2023HQZZ-07 甘肃省青年科技基金计划20JR5RA587 22JR5RA020 兰州市科技计划2023-1-8
==== Body
pmc骨折是骨科的常见病之一，目前促进骨折愈合主要以化学类药物如雌激素受体调节剂、甲状旁腺激素、双膦酸盐和降钙素为主，但可能导致骨肉瘤等不良后果［1］。骨折愈合是一个复杂的过程，包括炎症、血管生成、干细胞变化、成骨和软骨形成等，且5%~10%的骨折会发生延迟愈合或骨不连［2-3］。

随着生物学与医药、物理、化学等多学科的交叉发展，越来越多的物理疗法如光疗、磁疗、电烤等均已应用于康复医学［4］。电磁场因其操作简单且无创伤、无感染的特点在骨代谢疾病和康复医学中具有潜在的应用价值［5-6］。正弦电磁场能够通过与生物体内的电磁场相互耦合共振后对生物大分子、构象及功能产生影响，同时对生物体内的细胞增殖、分化发挥作用，从而影响机体的生理和生化改变。正弦电磁场调节骨代谢具有“窗效应”，即存在“强度窗”效应和“时间窗”效应。前期研究结果已证实，50 Hz 1.8 mT的SEMF可以促进成骨细胞成熟矿化、增加青年期大鼠峰值骨量、预防去势大鼠和尾吊大鼠的骨丢失，且已初步证实SEMF可通过改善组织微结构促进骨折愈合［7-9］。结合前期研究结果，本文通过研究SEMF在促进骨折愈合过程中对血管因子以及成骨相关蛋白表达的影响，探讨其促进骨折愈合的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器

实验采用SPF级雄性Wistar大鼠30只，体重为210~230 g。Wistar大鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所，动物合格证号：SCXK（甘）2014-0006-152。大鼠饲养于塑胶笼具，每笼饲养密度不超过10只。饲养条件为室温22~26 ℃，相对湿度保持在40%~70%，自由摄食饮水。

戊巴比妥钠购于国药集团上海有限公司；COL-1、OSX、RUNX2、VEGF、β-actin蛋白一抗和辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G均为英国Abcam公司产品；高效RIPA裂解液、ECL Plus超敏发光液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶制备试剂盒、蛋白质分子量标准（Maker）均为北京索莱宝科技有限公司产品；多聚甲醛为武汉赛维尔生物科技有限公司产品；Microfil血管造影剂为美国FlowTech公司产品；各规格离心管和枪头为美国Kirgen公司产品。

电磁场治疗仪由本团队和中国科学院兰州近代物理研究所共同研制；VISION90小动物X光机为丹东奥龙射线仪器集团有限公司产品；NMC-100小动物微型CT系统为平生医疗科技（昆山）有限公司产品；钛合金克氏针为惠州华阳医疗器械有限公司产品；骨科钻为上海紫霭医疗器械有限公司产品；可吸收缝合线为上海浦东金环医疗用品股份有限公司产品；BX51正置荧光显微镜为日本Olympus公司产品；酶标仪为美国Bio-Tek公司产品；电泳仪为美国Bio-Rad公司产品；IMS-50全自动雪花制冰机为常熟市雪科电器有限公司产品；H1650R台式高速冷冻离心机为湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；Scientz-48L冷冻型高通量组织研磨器为宁波新芝生物科技股份有限公司产品。

1.2 动物造模及分组

按照体重将30只Wistar大鼠分为模型对照组和SEMF干预组（SEMF组），每组15只。适应性驯化一周后，各组大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行麻醉，建立开放性大鼠股骨骨折模型。建模完成后的大鼠立即使用X线拍片，确保建模成功。两组大鼠在建模后肌内注射青霉素抗炎处理一周。SEMF组建模后每天早上9点至11点给予50 Hz 1.8 mT的SEMF电磁场治疗90 min，模型对照组自然生长。严格按照“3R”原则设计动物实验，研究方案通过第九四〇医院科研伦理委员会审查（2020KYLL128）。

1.3 X线检查判断骨痂形成情况

采用俯卧位，每两周对各组大鼠麻醉后分别行X线检查以观察大鼠骨痂形成情况，并进行评分。具体评分规则：断端未见骨痂为Ⅰ级，记为0分；断端边缘模糊、少量骨痂形成为Ⅱ级，记为1分；断边边缘进一步模糊、骨痂量增多但缺损未填满为Ⅲ级，记为2分；断处边缘完全消失、缺损处骨痂填满为Ⅳ级，记为3分。

1.4 显微CT扫描术侧股骨观察骨折愈合情况

8周后随机从各组中取3只大鼠分离术侧股骨，剔除多余软组织，拔出髓内钉并固定于4%多聚甲醛溶液中室温保存。72 h后进行显微CT扫描，分别截取平面横切图、立体横切图和立体重建图分析骨折愈合情况。扫描条件：采集模式为连续扫描，管压90 kV，管电流0.05 mA，总帧数4000，床位数3，扫描速度20帧/s，扫描空间分辨率7 μm。扫描后使用设备自带软件进行三维重建，以骨折线为中心上下各取100层计算骨体积分数，即骨小梁占总骨量的百分数。

1.5 血管造影扫描观察血管生长情况

8周后随机从各组中取3只大鼠，全身麻醉后打开胸腔将心脏充分暴露于视野下。将连接注射器的采血针刺入左心室2~3 mm处，用止血钳固定，并剪开右心耳。先用注射器吸取37 ℃含10 IU/mL低分子量肝素钠的等渗氯化钠溶液进行灌注使血液排除干净，再用新注射器吸取多聚甲醛进行灌注固定，后更换注射器吸取Microfil造影液进行再灌注，灌注速度为3 mL/min。灌注完成后将创口进行结扎，并在4 ℃冰箱保存过夜。次日分离术侧股骨组织，拔出髓内针后于4%的多聚甲醛中固定48 h。固定完成后用10% EDTA进行脱钙，脱钙完成后用显微CT进行扫描分析。

1.6 蛋白质印迹法检测骨组织相关蛋白表达

分别于实验开始2、4周时每组随机处死3只大鼠，分离术侧股骨，在超净工作台内逐个拔出克氏针，剪掉股骨头两端，使用磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔，将剩余骨组织放入1.5 mL离心管并在液氮中冷冻。每管放入3颗研磨钢珠在组织研磨器中研磨，重复三次，按照骨组织∶裂解液为100 mg∶500 μL的比例加入高效RIPA裂解液30 min后，5180×g离心30 min以分离上清液提取蛋白。根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书绘制标准曲线，计算蛋白浓度；采用蛋白质印迹法检测COL-1、OSX、RUNX2和VEGF蛋白表达量，BIO-RAD蛋白质印迹分析系统进行条带曝光，并用ImageJ软件分析相应条带灰度值。

1.7 安全性评价

1.7.1 大体观察大鼠活动状态

实验过程中密切观察大鼠生理应激反应和生活习性的变化。每天检查手术伤口是否发生开裂或感染，注意皮毛色泽是否异常，腹腔有无肿胀及健肢代偿。每周称取体重一次并记录进食量和进水量。观察可吸收缝合线是否发生脱落。

1.7.2 HE染色观察大鼠重要器官组织病理学变化

将大鼠处死后，剥离心、肝、脾、肺、肾，并将周围脂肪及黏膜组织剔除干净后，迅速固定于甲醛水溶液中。固定72 h后进行石蜡包埋、切片，行HE染色，显微镜下观察各器官病理学变化，由资深临床病理医生进行评价。

1.8 统计学方法

采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（ x¯ ±s）表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SEMF对模型鼠骨痂形成的影响

X线检查结果显示，治疗2周时，SEMF组大鼠骨痂大量形成并连接成骨桥；治疗4周时，SEMF组大鼠可见明显骨痂退化、仅少量云雾状骨痂尚存、骨折线模糊，而模型对照组才开始形成大量骨痂；治疗6周时，SEMF组大鼠骨痂完全消失、骨折线几乎闭合，而模型对照组仍有少量骨痂桥接骨折位置；治疗8周时，SEMF组大鼠骨折线完全消失、骨髓腔贯通，而模型对照组仍隐约可见骨折线缝隙，见图1。骨痂评分结果显示，SEMF组在治疗2、4、6、8周时的骨痂评分均高于模型对照组（均P<0.01），见图2。结果提示，SEMF治疗可加速大鼠骨折端骨痂的生长速度。

图1 两组大鼠骨折愈合X线图像

Figure 1 Comparison of fracture healing between two groups of rats

SEMF组在治疗周期内骨痂优先形成并桥接，后与骨折线逐渐消失并贯通骨髓腔；模型对照组4周时才出现大量骨痂且在治疗结束后骨痂桥接仍未退化，依然可见骨折线. SEMF：正弦交变电磁场.

图2 两组大鼠骨痂评分比较（n=15）

Figure 2 Comparison of bone scab scores between two groups of rats （n=15）

与模型对照组比较，**P<0.01. SEMF：正弦交变电磁场.

2.2 SEMF对大鼠骨折愈合的影响

显微CT平面横切图显示，SEMF组治疗8周后皮质骨骨折线消失，骨折位置连接光滑，隐约可见少量尚未褪去的骨组织纤维结构；而模型对照组尚存大量正在桥接的骨组织纤维结构，且骨折缝隙还未消失。显微CT立体横切图显示，SEMF组治疗8周后骨髓腔内侧皮质骨光滑，髓腔内贯通；而模型对照组骨折处仍在钙化。显微CT立体重建图显示，SEMF组治疗8周后皮质骨表面光滑，骨折痕迹完全消失；而模型对照组骨折处仍在塑形，骨折痕迹明显。见图3。SEMF组治疗8周后骨体积分数（0.243±0.012）显著高于模型对照组（0.186±0.008），差异具有统计学意义（t=－7.017，P<0.01）。结果提示，SEMF治疗可加快大鼠骨折部位的修复重建。

图3 两组大鼠治疗8周后术侧骨组织显微CT影像

Figure 3 Comparison of micro-CT scanning result of the operated bone tissue between two groups of rats after 8 weeks treatment

平面横切图显示SEMF组骨折线消失且连接光滑，而模型对照组骨折线明显且仍处于桥接状态；立体横切图显示SEMF组髓腔完全贯通，而模型对照组仍在钙化；立体重建图显示SEMF组骨折痕迹完全消失，而模型对照组塑形尚未完成. SEMF：正弦交变电磁场；CT：计算机断层扫描.

2.3 SEMF对大鼠血管生成的影响

血管造影结果显示，SEMF组治疗8周后大量小细血管已经贯穿骨折区域，血管贯通良好，血管数明显增多；而模型对照组大量血管仍处于断裂状态，贯通性较差，血管数相对较少，见图4。结果提示，SEMF治疗可加速完成大鼠骨折部位血管的连接贯通。

图4 两组大鼠治疗8周后术侧股骨血管造影像

Figure 4 Comparison of femoral angiography on the operative side between two groups of rats after 8 weeks treatment

SEMF组血管已贯通且血管数较多，而模型对照组血管断裂且血管数较少. SEMF：正弦交变电磁场.

2.4 SEMF对大鼠骨组织相关蛋白表达的影响

SEMF组治疗2、4周时，血管生成因子VEGF和骨形成相关因子COL-1、RUNX2、OSX的蛋白表达量较模型对照组均有明显增加（图5）。用ImageJ软件扫描灰度值结果显示，SEMF组在治疗2、4周时，VEGF、COL-1、RUNX2和OSX的灰度值扫描结果均显著高于模型对照组（均P<0.05），见表1。结果提示SEMF治疗提高了骨形成和血管生成相关因子的蛋白表达量。

图5 两组大鼠骨组织相关蛋白表达电泳图

Figure 5 Electrophoretogram of bone tissue-associated proteins in two groups of rats

治疗2、4周时，SEMF组的骨组织相关蛋白表达量相比模型对照组均增加. SEMF：正弦交变电磁场；actin：肌动蛋白；COL-1：Ⅰ型胶原蛋白；OSX：成骨细胞特异性转录因子；RUNX：Runt相关转录因子；VEGF：血管内皮生长因子.

表1 两组大鼠骨组织相关蛋白表达水平比较

Table 1 Comparison of bone tissue-associated protein expressions between two groups of rats

组 别	第2周	第4周	
COL-1	OSX	RUNX2	VEGF	COL-1	OSX	RUNX2	VEGF	
模型对照组	0.608±0.074	0.405±0.052	0.867±0.087	1.117±0.172	0.165±0.002	0.417±0.065	0.599±0.080	1.197±0.017	
SEMF组	0.990±0.004	0.514±0.047	1.070±0.083	1.299±0.019	0.797±0.012	1.050±0.127	1.057±0.124	1.397±0.023	
t值	－8.851	－2.689	－2.931	－1.824	－88.099	－7.702	－5.365	－12.064	
P值	<0.05	>0.05	<0.05	>0.05	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01	
COL-1：Ⅰ型胶原蛋白；OSX：成骨细胞特异性转录因子；RUNX：Runt相关转录因子；VEGF：血管内皮生长因子；SEMF：正弦交变电磁场.

x¯ ±s，n=3

2.5 SEMF处理大鼠的不良反应评估

8周实验过程中，两组大鼠进食量、进水量和体重均无明显变化，手术伤口均正常生长且无感染情况，皮毛色泽均无明显变化，腹腔无肿胀，未出现健肢代偿。HE染色结果显示，两组大鼠心、肝、脾、肺、肾等各器官的组织病理学无明显差异，见图6。结果提示SEMF治疗无明显不良反应。

图6 两组大鼠治疗8周后主要器官组织病理学检查结果（HE染色）

Figure 6 Histopathological results of major organs between two groups of rats after 8 weeks treatment （HE staining）

两组大鼠各器官组织学表现均未发生明显改变. 标尺=100 μm. SEMF：正弦交变电磁场.

3 讨论

骨折是人类最常见的大器官损伤，从骨折发生至愈合往往需要经历漫长的过程和一系列复杂的生理变化［10］。电磁场作为一种非侵入性、安全的物理疗法在治疗骨性关节炎、骨质疏松及骨折疾病中已应用多年，且越来越受到广大医生及患者的青睐［11］。本文采用50 Hz 1.8 mT的SEMF每天干预骨折模型大鼠90 min，通过X线评估骨痂形成情况、蛋白质印迹法检测成骨和血管生长因子相关蛋白、显微CT扫描观察骨折愈合情况、血管造影观察血管生长情况等方式证明SEMF对大鼠骨折愈合有明显的促进作用，并通过大体和微观观察，结果提示SEMF具有良好的生物安全性。

影像学检查是骨折发生后评价及诊断最常用的方法，其能快速定位骨折发生的具体部位［12］。X线对骨折的检测较为直观，且操作便利、可快速成像，为诊断的首选方法［13］。本研究通过拍摄不同时间段的X线片，观察大鼠的骨折愈合情况。SEMF能够促进骨折区域骨痂的生长，使纤维骨痂更早向骨性骨痂转化，加速骨痂重塑，恢复皮质骨连续性和髓腔再通，更快地完成了骨折愈合。显微CT扫描及三维重建结果能够更加全面地了解骨折形态，特别是骨折移位、垂直不稳、粉碎性骨折等情况，其对骨折的诊断更为准确［13］。大鼠骨折股骨三维重建图显示，SEMF干预组大鼠骨折区域表面光滑平整，骨痂基本消失，皮质骨连续性较好，无明显缝隙，提示该组已经完成了骨痂的塑性改造，骨骼生长情况已接近骨折前的生理状态。这一结果与X线检查结果一致，表明SEMF可以通过加速骨折端骨痂生长速度，加快大鼠骨折部位的修复重建。

骨折常伴随血管的损伤甚至断裂，骨折愈合的过程中血管会出现再生和连接贯通［14］。在骨折愈合过程中，往往需要足够稳定和充分的血液供应，血液中含有的营养物质和成骨细胞能够促进骨折的恢复，血管连接和贯通越好则骨折愈合的情况也越好。因此，血供的恢复对骨折愈合的意义重大。本研究通过对大鼠骨折股骨进行血管造影观察血管的生成和分布情况。结果显示，SEMF组骨折区域血管更加密集，已有直径较大的血管贯穿骨折断端，断裂的血管基本接续。由此可知，SEMF能够通过增加血管数、促进血管生成从而加速骨折的愈合。

COL-1、OSX、RUNX2是成骨细胞活性的特异性指标，能调节成骨细胞和软骨细胞的增殖分化，在促进骨形成过程中发挥重要作用［15］。本文资料显示，SEMF组治疗2、4周后，COL-1、OSX、RUNX2表达较模型对照组均有显著增加，说明骨折治疗过程中，成骨细胞表达较为活跃，成骨相关因子对骨折重建起到了正向调节的作用。VEGF能够促进组织修复、诱导毛细血管生成，是作用强大、特异性好的血管生成因子［16］。本文资料显示，在大鼠骨折愈合过程中，SEMF能提高VEGF表达，促进血管生成和骨代谢，从而加速骨折愈合。SEMF组血管生成数增多可能与VEGF高表达密切相关。

本研究还考察了SEMF对实验大鼠的安全性。在整个实验周期中，两组大鼠饮食饮水及体重均未出现异常，手术切口以及皮毛色泽等生长状态良好，未见腹腔肿胀及健肢代偿，其主要器官组织HE染色结果均显示正常。可见研究中大鼠生存状态良好、生理活动符合预期，提示SEMF具有良好的安全性。

骨折愈合过程复杂，既需要成骨细胞、软骨细胞、破骨细胞等参与骨形成的重建修复，也需要血管生长因子的调节来供给血液。在临床上，如何安全有效地促进患者骨折愈合是骨科医生亟待解决的难题。本研究从影像学、病理学等角度证实了50 Hz 1.8 mT的SEMF能够显著促进骨折愈合、缩短愈合时间，并具有良好的安全性。但是，SEMF缺乏系统性的安全评价，且其具体作用机制尚未阐明，仍有待进一步研究，以便推广至临床应用。

研究得到军队后勤自主科研项目（2023HQZZ-07）、甘肃省青年科技基金计划（20JR5RA587，22JR5RA020）和兰州市科技计划（2023-1-8）资助

This work was supported by the Army Logistics Research Optional Program (2023HQZZ-07), Youth Science and Technology Fund Program of Gansu Province (20JR5RA587, 22JR5RA020), and Science and Technology Program of Lanzhou City (2023-1-8)

利益冲突声明

所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of Interests

The authors declare that there is no conflict of interests

［缩略语］

正弦交变电磁场（sinusoidal alternating electromagnetic field，SEMF）；无特定病原体（specific pathogen free，SPF）；Ⅰ型胶原蛋白（type Ⅰ collagen，COL-1）；成骨细胞特异性转录因子（osterix，OSX）；Runt相关转录因子（Runt-related transcription factor，RUNX）；血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）；放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）；计算机断层扫描（computed tomography，CT）；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）；苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色）
==== Refs
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