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Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban
Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban
ZJYB
Journal of Zhejiang University (Medical Sciences)
1008-9292
《浙江大学学报》编辑部 杭州市天目山路148号浙江大学西溪校区浙江大学出版社415室

39183061
1008-9292(2024)04-0490-08
10.3724/zdxbyxb-2024-0104
2024-0104
R515
a
Original Articles
血液感染来源肺炎克雷伯菌毒力与碳青霉烯类耐药表型的关系及碳青霉烯类耐药高毒力菌株的鉴定
Relationship between virulence and carbapenem resistance phenotype of Klebsiella pneumoniae from blood infection: identification of a carbapenem-resistant and hypervirulent strainhttp://orcid.org/0000-0002-5503-1985
廖 全凤 LIAO Quanfeng
张 为利 ZHANG Weili
邓 劲 DENG Jin
吴 思颖 WU Siying
刘 雅 LIU Ya
肖 玉玲 XIAO Yuling
http://orcid.org/0000-0002-6625-4834
康 梅 KANG Mei
四川大学华西医院实验医学科，四川 成都 610041
Department of Laboratory Medicine, West China Hospital, Sichuan University Chengdu 610041 China
余 方
沈 敏
康 梅，主任技师，主要从事病原微生物相关工作；E-mail：kangmei@sina.com；https：//orcid.org/0000-0002-6625-4834
KANG Mei, E-mail: kangmei@sina.com, https://orcid.org/0000-0002-6625-4834
廖全凤，主管技师，主要从事病原微生物相关工作；E-mail：1140603838@qq.com；https：//orcid.org/0000-0002-5503-1985

25 8 2024
53 4 294 490497
25 3 2024
18 4 2024
2024
The Author(s)
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)
目的

探讨本地区从血培养分离的肺炎克雷伯菌临床株的毒力与碳青霉烯类耐药表型的关系，并对碳青霉烯类耐药高毒力肺炎克雷伯菌（CR-HVKP）进行毒力表型验证。

方法

收集2016—2019年血流感染患者血培养分离的192株非重复肺炎克雷伯菌，其中96株为碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CRKP），96株为碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌（CSKP）。采用VITEK-2全自动微生物分析仪检测菌株对药物的敏感性，聚合酶链反应检测碳青霉烯类耐药基因、毒力基因和荚膜分型，拉丝实验检测菌株的高黏表型，全基因组测序方法检测CR-HVKP菌株的基因组特征，并通过血清抗性试验和生物膜形成试验进一步验证CR-HVKP的毒力。

结果

CRKP对常见抗菌药物耐药率高，CSKP则对常见抗菌药物较敏感；除米诺环素外，CRKP组和CSKP组菌株对抗菌药物的耐药率差异均有统计学意义（均P<0.05）。96株CRKP中，92株携带碳青霉烯酶基因，以blaKPC-2 为主。在毒力因子方面，4株CRKP和36株CSKP拉丝试验阳性，呈现为高黏表型，两者差异具有统计学意义（P<0.05）。与CRKP组比较，CSKP组Kfu、aerobictin、iutA、ybtS、rmpA、magA、allS等毒力基因检出率均增加，荚膜抗原K1和K2检出率也增加（均P<0.05）。CRKP组检出高毒力肺炎克雷伯菌（HVKP）1株（即CR-HVKP），CSKP组检出HVKP 36株，差异有统计学意义（P<0.05）。全基因组测序结果显示，CR-HVKP多位点序列分型为412，荚膜抗原为K57，携带iutA、entB、mrkD、fimH和rmpA毒力基因，生物膜形成能力和血清抵抗力强，同时携带blaSHV - 145 、blaTEM - 1 、blaCTX - M - 3 、fosA6、oqxA5、oqxB26和aac（3）-IId耐药基因，伴随外膜蛋白K（OmpK）35和OmpK36的异常。

结论

CRKP对抗菌药物的耐药率明显高于CSKP，虽然其携带的毒力基因数和种类均少于CSKP，但也出现了碳青霉烯类耐药且高毒力的新型多位点序列分型肺炎克雷伯菌。后者可能对公共卫生造成严重威胁。

Objective

To investigate the relationship between the virulence and the carbapenem resistance phenotype of Klebsiella pneumoniae from blood infection, and to identify carbapenem-resistant and hypervirulent Klebsiella pneumoniae (CR-HVKP)strains.

Methods

A total of 192 Klebsiella pneumoniae strains were isolated from blood culture of patients with bloodstream infections from 2016 to 2019, of which 96 isolates were carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae (CRKP) and 96 were carbapenem-sensitive Klebsiella pneumoniae (CSKP). The drug susceptibility was detected by VITEK-2 automatic microbial analyzer; carbapenemase genes, virulence genes and capsule typing were detected by polymerase chain reaction; the high viscosity phenotype of strains was detected by string test, and the genome characteristics of CR-HVKP were detected by whole genome sequencing. Serum killing and biofilm formation test were used to further verify the virulence of CR-HVKP.

Results

There were significant differences in drug resistance to common antibiotics, except for minocycline between CSKP and CRKP isolates (all P<0.05). 92 out of 96 CRKP isolates carried carbapenemase genes, mainly blaKPC - 2 . The string tests were positive in 4 isolates of CRKP and 36 isolates of CSKP (P<0.05). The detection rates of virulence genes Kfu, aerobictin, iutA, ybtS, rmpA, magA, allS, and capsule antigen K1 and K2 in CSKP group were significantly higher than those in CRKP group (all P<0.05). One HVKP strain was detected in the CRKP group (CR-HVKP) and 36 HVKP was detected in the CSKP group (P<0.05). The CR-HVKP strain belonged to the MLST412, serotype K57, expressed iutA, entB, mrkD, fimH, and rmpA virulence genes, and showed strong biofilm formation and significantly increased serum resistance. Whole genome sequencing results showed that this CR-HVKP isolate carried blaSHV - 145 , blaTEM - 1 , blaCTX - M - 3 , fosA6, oqxA5, oqxB26, and aac(3)-IId resistance genes, accompanied by abnormalities in outer membrane protein K (OmpK) 35 and OmpK36.

Conclusions

The drug resistance of CRKP is significantly higher than that of CSKP, while CRKP carrying fewer virulence genes in both number and types compared to CSKP. A new MLST type of carbapenem-resistant and hypervirulent Klebsiella pneumoniae strain has been detected, which requires clinical awareness and epidemiological monitoring.

肺炎克雷伯菌
碳青霉烯类耐药
血流感染
毒力
毒力基因
荚膜分型
Klebsiella pneumoniae
Carbapenem-resistance
Bloodstream infection
Virulence
Virulence gene
Capsule typing
==== Body
pmc血流感染可发展为严重脓毒血症、感染性休克和多器官衰竭综合征，患者病死率为28%~41%［1］，其中由肺炎克雷伯菌引起的血流感染患者病死率可达50%左右［2-3］。上世纪八十年代，中国台湾地区发现了第一例造成致死性化脓性肝脓肿的HVKP，随后全世界范围内相继报道，主要的荚膜分型为K1和K2［4-5］。HVKP一般具有高黏表型、毒力和传播力强等特征，主要可引起肝脓肿和脓毒血症等，其主要毒力因子为荚膜、菌毛、铁载体和脂多糖［6］。研究显示，大多数HVKP对常用抗菌药物敏感［7］。但近年来肺炎克雷伯菌的耐药水平日益提高，CRKP的检出率不断升高。CHINET（www.chinets.com）数据显示，2023年CRKP检出率约为30%。CRKP对大多数抗菌药物耐药，临床治疗棘手。一项纳入129例CRKP血流感染患者的研究显示，患者28 d病死率为80.6%［8］。以往，耐药和毒力是两种不重叠的表型，然而最近有研究报道了CR-HVKP感染病例［9］，兼具高毒力和耐药特性，且CR-HVKP可从不同临床环境中分离出来［10-11］，这给临床治疗带来了巨大挑战。

本研究基于四川大学华西医院2016—2019年收治的血流感染患者中收集的肺炎克雷伯菌，从分子水平探讨菌株毒力与碳青霉烯类耐药性的关系，并对CR-HVKP的毒力表型进行验证，为医院感染防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源、仪器及试剂

收集2016—2019年四川大学华西医院血流感染患者血培养分离的192株非重复肺炎克雷伯菌，其中96株为CRKP，96株为CSKP。

VITEK-2全自动微生物分析仪为法国BioMerieux公司产品；PCR仪器为美国Bio-Rad公司产品；Illumina HiSeq X10测序平台为美国Illumina公司产品；培养基为郑州安图生物工程股份限公司产品；药敏试纸为英国Oxoid公司产品；DNA提取试剂盒为德国Qiagen公司产品。

大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853和金黄色葡萄球菌ATCC25923为药敏试验质控菌株；肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705（blaKPC 阳性）、肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706（碳青霉烯酶基因阴性）和肺炎克雷伯菌ATCCBAA-2146（blaNDM 阳性）为PCR质控菌株。

1.2 全自动微生物分析仪检测抗菌药物敏感性

通过VITEK-2全自动微生物分析仪对菌株进行药敏试验，根据临床实验室标准协会指南（CLSI-M100）对最低抑菌浓度值进行判读。

1.3 PCR检测碳青霉烯酶基因

通过PCR检测五种常见的碳青霉烯酶基因（blaKPC 、blaNDM 、blaVIM 、blaIMP 和blaOXA ），对纯化符合预期大小的PCR产物进行测序验证。

1.4 拉丝实验结合PCR检测鉴定菌株的高黏表型、毒力基因和荚膜分型

采用拉丝实验鉴定高黏表型［12］。使用标准接种环挑取单个菌落，拉丝在5 mm及以上视为菌株具有高黏表型。通过PCR检测6种荚膜血清型（K1、K2、K5、K20、K54、K57）和magA、allS、rmpA、mrkD、fimH、Kfu、entB、ybtS、铁载体需氧菌素（aerobictin）和iutA等10种毒力基因［13-15］。将携带rmpA和iutA基因同时具有高黏表型的菌株定义为HVKP［6， 16-18］。

1.5 全基因组测序检测CR-HVKP的基因组特征

采用DNA提取试剂盒提取CR-HVKP菌株的基因组DNA，通过Illumina HiSeq X10平台进行基因组测序，使用Sickle（GitHub）和SPAdes 3.8软件修剪并组装基因组，再通过Institut Pasteur（http：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/）、ResFinder（http：//genomicepidemiology.org/）和Pasteur（http：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/）等数据库分别对CR-HVKP菌株的MLST、耐药基因和毒力基因进行比对鉴定。

1.6 生物膜形成试验检测菌株的生物膜形成能力

通过生物膜形成试验［13］检测CR-HVKP菌株的毒力。选取6株肺炎克雷伯菌（不携带碳青霉烯酶基因CRKP、CSKP、携带碳青霉烯酶基因CRKP、CS-HVKP、CR-HVKP、标准菌株ATCC700603），以无菌LB肉汤作为空白对照测定菌株的生物膜形成。根据吸光度值将菌株生物膜形成能力分为弱（吸光度值≤0.4）、中（吸光度值>0.4~0.6）、强（吸光度值>0.6）。

1.7 血清抗性实验检测CR-HVKP菌株对血清抗体的反应

采用血清抗性实验［13］验证CR-HVKP的毒力。选取6株肺炎克雷伯菌（不携带碳青霉烯酶基因CRKP、CSKP、携带碳青霉烯酶基因CRKP、CS-HVKP、CR-HVKP、标准菌株ATCC700603）与人正常血清混合，观察活菌数。根据活菌数将血清抗性的反应分为六个等级：血清敏感（1或2级）、中度敏感（3或4级）和血清抵抗（5或6级）。

1.8 统计学方法

采用WHONET和SPSS 22.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量数据以均数±标准差（ x¯ ±s）描述。计数数据以百分比（%）描述，组间比较采用χ 2检验，当n<5时，使用Fisher精确检验。P<0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism软件绘图。

2 结果

2.1 不同耐药表型菌株对常见抗菌药物的耐药性比较

96株CRKP和96株CSKP对常见抗菌药物的耐药性见表1。CRKP对头孢类、酶抑制剂类和碳青霉烯类药物耐药率均在90%以上，对氨基糖苷类耐药率相对较低；CSKP则对头孢类、酶抑制剂类、氨基糖苷类和碳青霉烯类药物保持较好的敏感性。除米诺环素外，两组菌株对常见抗菌药物的耐药率差异均有统计学意义（均P<0.05）。结果提示，CRKP对抗菌药物耐药率明显高于CSKP。

表1 碳青霉烯类敏感和耐药肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药率比较

Table 1 Comparison of drug resistance in carbapenem-sensitive and carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

抗菌药物	CSKP	CRKP	抗菌药物	CSKP	CRKP	
哌拉西林	32.3	100.0**	厄它培南	0.0	100.0**	
哌拉西林舒巴坦	7.3	98.9**	亚胺培南	0.0	95.8**	
阿莫西林克拉维酸	9.4	100.0**	美罗培南	0.0	98.9**	
头孢哌酮舒巴坦	4.2	98.9**	庆大霉素	8.3	72.9**	
头孢呋辛	25.0	100.0**	阿米卡星	0.0	64.2**	
头孢他啶	11.5	95.8**	环丙沙星	16.7	88.5**	
头孢曲松	11.5	97.9**	左氧氟沙星	13.5	88.5**	
头孢噻肟	24.0	98.9**	四环素	36.5	53.7*	
头孢泊肟	26.0	100.0**	米诺环素	24.4	25.6	
头孢吡肟	7.3	97.8**	复方磺胺甲 唑	19.8	62.4**	
氨曲南	14.6	93.8**				
与CSKP比较，* P<0.05，** P<0.01. CSKP：碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌；CRKP：碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌.

%，n=96

2.2 不同耐药表型菌株碳青霉烯酶基因检测结果

96株CRKP中，检出碳青霉烯酶基因92株，其中77株（83.7%）仅检出blaKPC - 2 ，11株（12.0%）仅检出blaNDM - 5 ，4株（4.3%）同时检出两种基因（2株同时检出blaKPC - 2 和blaNDM - 1 ，2株同时检出blaKPC - 2 和blaNDM - 5 ）。96株CSKP均未检出碳青霉烯酶基因。结果提示，CRKP菌株对碳青霉烯类药物耐药的主要机制是产碳青霉烯酶，以blaKPC - 2 基因为主。

2.3 不同耐药表型菌株高黏表型、毒力基因和荚膜分型检测结果

经检测，CRKP中4株（4.2%）具有高黏表型，而CSKP中36株（37.5%）具有高黏表型，两者高黏表型差异具有统计学意义（P<0.01）。

96株CRKP中，检出荚膜抗原3株（3.1%），均为携带K57。96株CSKP中，检出荚膜抗原37株，其中20株（20.8%）携带K1，13株（13.5%）携带K2，2株（2.1%）携带K5，1株（1.0%）携带K20，1株（1.0%）携带K54。CRKP和CSKP中entB、mrkD和fimH基因检出率均超过90.0%，两组间差异无统计学意义。Kfu、aerobictin、iutA、ybtS、rmpA、magA、allS以及荚膜抗原K1和K2在CSKP的检出率均高于CRKP（均P<0.01）。见表2。CRKP与CSKP携带的毒力基因种类亦存在差异：CRKP中87.5%携带3种毒力基因，6.3%携带4种毒力基因；而CSKP中33.3%携带3种毒力基因，17.7%携带10种毒力基因，13.5%携带7种毒力基因。根据1.4中HVKP的定义，CRKP中1株为HVKP（CR-HVKP），CSKP中36株为HVKP，两者HVKP比例差异具有统计学意义（P<0.01）。结果提示CRKP毒力基因携带率低于CSKP。

表2 碳青霉烯类敏感和耐药肺炎克雷伯菌毒力基因或荚膜抗原检出情况比较

Table 2 Comparison of virulence genes or capsule antigen in carbapenem-sensitive and carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

毒力基因或荚膜抗原	CRKP（%）	CSKP（%）	P值	
entB	100.0	100.0	—	
mrkD	94.8	94.8	>0.05	
fimH	97.9	92.7	>0.05	
aerobictin	1.0	53.1	<0.01	
rmpA	3.1	51.0	<0.01	
iutA	4.2	51.0	<0.01	
ybtS	0.0	41.7	<0.01	
Kfu	8.3	35.4	<0.01	
allS	3.1	20.8	<0.01	
magA	0.0	20.8	<0.01	
K1	0.0	20.8	<0.01	
K2	0.0	13.5	<0.01	
K5	0.0	2.1	>0.05	
K20	0.0	1.0	>0.05	
K54	0.0	1.0	>0.05	
K57	3.1	0.0	>0.05	
未检出荚膜多糖	93.0	59.0	<0.01	
—：无相关资料. CSKP：碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌；CRKP：碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌；entB：铁载体肠杆菌素；mrkD：黏附因子3型菌毛基因；fimH：黏附因子1型菌毛基因；aerobictin：铁载体需氧菌素；rmpA：黏液样表型A调节基因；iutA：铁载体气杆菌素；ybtS：铁载体耶尔森杆菌素；Kfu：克雷伯菌铁摄取蛋白；allS：尿囊素代谢基因；magA：黏液相关基因A.

2.4 CR-HVKP菌株的基因组特征和药敏试验结果

CR-HVKP菌株分离自重症监护病房的一例41岁急性白血病女性患者，同时患有肺炎和肝包虫病，并发感染性休克。PCR未检测到该株CR-HVKP菌株携带碳青霉烯类基因，全基因组测序结果显示其携带blaSHV - 145 、blaTEM - 1 、blaCTX - M - 3 、fosA6、oqxA5、oqxB26和aac（3）-IId耐药基因，MLST型别为412，OmpK35和OmpK36基因中存在IS10L插入序列，携带rmpA、iutA、entB、mrkD和fimH毒力基因，荚膜抗原分型为K57，具有高黏表型。药敏试验结果显示，该株CR-HVKP对头孢类、酶抑制剂、厄他培南和美罗培南耐药，对亚胺培南中介，对氟喹诺酮类敏感。由于患者存在免疫缺陷及多重感染，故采用头孢哌酮舒巴坦、利奈唑胺、莫西沙星、亚胺培南单用或联用进行抗感染治疗，同时接受长春瑞滨和顺铂化疗。患者最终因本次感染预后不佳要求出院。

2.5 CR-HVKP菌株的毒力鉴定结果

生物膜形成试验发现，不携带碳青霉烯酶基因CRKP、CSKP、携带碳青霉烯酶基因CRKP、CS-HVKP、CR-HVKP、标准菌株ATCC700603的吸光度值依次为0.480、0.297、0.628、0.500、0.767、0.292，其中CR-HVKP生物膜形成能力最强，其后依次为携带碳青霉烯酶基因CRKP（强）、CS-HVKP（中等）、不携带碳青霉烯酶基因CRKP（中等）、CSKP（弱）和标准菌株ATCC700603（弱）。血清抗性试验结果显示，CR-HVKP和CS-HVKP为高抵抗（6级），携带碳青霉烯酶基因CRKP为中等抵抗（4级），其余菌株对血清无抵抗（2级），见图1。结果表明，CR-HVKP菌株的毒力较CRKP、CSKP和CS-HVKP菌株均有明显提高。

图1 六株肺炎克雷伯菌血清抗性试验结果

Figure 1 Serum killing test results of six Klebsiella pneumoniae strains

CR-HVKP携带5个毒力基因（entB、rmpA、mrkD、iutA和fimH），呈现高黏表型，未检测到碳青霉烯酶基因；不携带碳青霉烯酶基因CRKP携带3个毒力基因（entB、mrkD和fimH）；携带碳青霉烯酶基因CRKP携带blaKPC-2 基因和3个毒力基因（entB、mrkD和fimH）；CS-HVKP携带7个毒力基因（entB、mrkD、fimH、iutA、rmpA、ybtS和aerobictin），呈现高黏表型；CSKP携带3个毒力基因（entB、mrkD和fimH）. CR-HVKP：碳青霉烯类耐药高毒力肺炎克雷伯菌；CRKP：碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌；CS-HVKP：碳青霉烯类敏感高毒力肺炎克雷伯菌；CSKP：碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌；entB：铁载体肠杆菌素；rmpA：黏液样表型A调节基因；mrkD：黏附因子3型菌毛基因；iutA：铁载体气杆菌素；fimH：黏附因子1型菌毛基因；ybtS：铁载体耶尔森杆菌素；aerobictin：铁载体需氧菌素.

3 讨论

肺炎克雷伯菌引起的血液感染病死率高、患者住院时间延长和医疗费用增加［19］。全球肺炎克雷伯菌的耐药性和毒力水平升高，需要寻找新的治疗方案。本研究对四川大学华西医院192例血液感染的肺炎克雷伯菌进行分析，探讨肺炎克雷伯菌毒力因子与碳青霉烯类耐药性之间的关系。

本文资料显示，96株CRKP中携带blaKPC - 2 占83.7%，携带blaNDM - 5 占12.0%，同时携带blaKPC 和blaNDM 占4.3%，与Wang等［20］的研究结果基本一致。

肺炎克雷伯菌的耐药性已成为公认的治疗难题，而高毒力菌株的存在则会使得治疗更加困难。截至目前，与肺炎克雷伯菌毒力相关的因素主要有荚膜、铁载体、脂多糖、毒力质粒pLVPK和KPHP1208致病岛等［6］。本研究对肺炎克雷伯菌毒力相关的菌毛（mrkD、fimH）、铁载体（entB、aerobictin、iutA、ybtS、Kfu）、尿囊素代谢（allS）和荚膜（K1、K2、K5、K20、K54、K57、rmpA、magA）进行研究。其中，菌毛与细菌黏附有关；铁载体相关蛋白如Kfu蛋白可通过螯合作用促进游离铁吸收，并促进Kfu基因编码产物的产生，提高细菌的生长和定植能力［12］；在需氧或厌氧条件下，allS基因负责尿囊素的厌氧同化，作为碳、氮和能量的唯一来源，小鼠致死试验显示allS基因与菌株的毒力显著相关［12， 21］；荚膜可以保护细菌不被吞噬，通过阻止抗菌肽和补体在细菌表面的沉积，避免抗菌肽和补体的杀菌作用［17］。本文资料显示，CRKP和CSKP携带mrkD和fimH的比例均超过90%，表明肺炎克雷伯菌普遍产生Ⅰ型和Ⅲ型菌毛。但是，与CRKP比较，CSKP中aerobictin、iutA、ybtS和Kfu的阳性率明显升高，提示CSKP比CRKP具有更强的存活、定植和铁摄取能力；CSKP中allS基因和荚膜相关基因的阳性率也均高于CRKP，且与高毒力相关的荚膜血清型K1和K2在CSKP中更为常见，检出率分别为20.8%和13.5%。此外，既往研究显示，与侵袭性感染密切相关的allS和Kfu仅存在于荚膜血清型K1的肺炎克雷伯菌中［22］；而本研究在K57 CRKP和K1 CSKP分离株中均检出allS和Kfu基因，推测荚膜血清型K57菌株亦可能与侵袭性感染高度相关。此外，17.7% CSKP携带10种毒力基因，13.5% CSKP携带7种毒力基因，但大多数CRKP（87.5%）只携带3种毒力基因。上述结果提示，CRKP虽能抵抗抗菌药物，但其捕获铁离子和逃避宿主免疫攻击的能力不如CSKP；CRKP携带的毒力基因数和种类少于CSKP，荚膜抗原（K1和K2）主要存在于CSKP细菌中，其原因可能是基于能量平衡规律，在获得耐药基因的同时，毒力基因相对减少。

目前关于HVKP的定义仍存在争议。第一株HVKP分离自化脓性肝脓肿患者，该菌株同时具有高黏表型。此后，高黏表型被广泛用作HVKP的标志，即拉丝实验结果在5 mm及以上。但是，Russo等［23］评估了拉丝实验、毒力因子、荚膜分型等在HVKP检测中的作用，发现拉丝实验阳性菌株不一定具有黏液样表型，具有高黏液特征的菌株拉丝实验可呈阴性；尽管拉丝实验检测HVKP存在诸多问题，但其准确率可达90%；同时发现评价毒力准确率最高的毒力基因为iroB、iutA、rmpA和rmpA2，阳性率均超过95%。Yang等［24］也发现HVKP的拉丝实验未呈阳性，通过嗜中性粒细胞杀伤实验和大蜡螟感染模型证实携带rmpA/rmpA2、沙门菌素相关基因iroBCDN和需氧菌素铁摄入系统（iucABCD）的肺炎克雷伯菌具有较强的毒力。从临床表现来看，HVKP多引起患者转移性感染，如血流感染、化脓性肝脓肿、肺炎、胆道感染、软组织疾病和自发性细菌性腹膜炎［6， 25］。纳入本次研究的肺炎克雷伯菌均分离自血流感染患者，结合菌株的毒力特性（携带rmpA和iutA基因并具有高黏表型），本研究将符合这类特征的肺炎克雷伯菌定义为HVKP。本文资料中，共检出1株CR-HVKP和36株CS-HVKP。

本文资料中这株CR-HVKP菌株分离自重症监护病房的一例41岁女性血液肿瘤患者，虽然菌株对抗菌药物的敏感性较好，但住院期间使用头孢哌酮舒巴坦、利奈唑胺、莫西沙星和亚胺培南治疗后预后仍不理想。经检测，该株CR-HVKP不携带碳青霉烯酶基因，具有高黏表型，荚膜分型为K57，携带多种毒力基因（rmpA、iutA、entB、mrkD、fim），表现出较强的血清抵抗性和生物膜形成能力。进一步分析发现，CR-HVKP菌株携带blaSHV - 145 、blaTEM - 1 和blaCTX - M - 3 基因，OmpK35和OmpK36存在变异，MLST型别为412，推测该菌株对碳青霉烯类耐药的机制是OmpK35/OmpK36异常伴随ESBL的产生［26-27］。Zhang等［28］报道了一株MLST型别为65的CR-HVKP菌株，其携带blaCTX - 3 、blaDHA - 1 、blaSHV - 11 和blaTEM - 53 基因，伴随OmpK35/OmpK36表达减少，同时表达ESBL基因，为K2荚膜型，且携带rmpA、aerobactin和entB毒力基因，对除替加环素外的抗菌药物耐药；Li等［29］也报道了MLST型别为11型的CR-HVKP伴随OmpK35/OmpK36缺失。结合本文资料，推测OmpK35/OmpK36变异可能与HVKP的毒力相关，但有待进一步研究证实。

综上所述，CRKP对抗菌药物的耐药率明显高于CSKP，虽然其携带的毒力基因数和种类均少于CSKP，但也出现了碳青霉烯类耐药且高毒力的新型MLST型肺炎克雷伯菌。提示临床和实验室应关注这类病原菌，并结合患者临床症状和实验室提供的检测结果尽早明确诊断，对患者提前进行干预治疗，以期改善患者预后。

数据说明 本研究提供的全基因组测序数据可在NCBI Sequence Read Archive （SRA）中获得，检索号为PRJNA786277

Availability of data The whole genome sequencing data presented in this study is available in NCBI Sequence Read Archive (SRA) with the accession number PRJNA786277

利益冲突声明

所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of Interests

The authors declare that there is no conflict of interests

［缩略语］

高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，HVKP）；碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）；碳青霉烯类耐药高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant and hypervirulent Klebsiella pneumoniae，CR-HVKP）；碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌（carbapenem-sensitive Klebsiella pneumoniae，CSKP）；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）；碳青霉烯类敏感高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenem-sensitive and hypervirulent Klebsiella pneumonia，CS-HVKP）；黏液相关基因A（mucoviscosity-associated gene A，magA）；尿囊素代谢基因（allantoin metabolism，allS）；黏液样表型A调节基因（regulator of mucoid phenotype A，rmpA）；黏附因子3型菌毛基因（type 3 fimbria adhesin subunit MrkD，mrkD）；黏附因子1型菌毛基因（fimbrial adhesin，fimH）；克雷伯菌铁摄取蛋白（Klebsiella ferric iron uptake，Kfu）；铁载体肠杆菌素（enterobactin，entB）；铁载体耶尔森杆菌素（yersiniabactin， ybtS）；铁载体气杆菌素（ferri-aerobactin uptake，iutA）；多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）；外膜蛋白K（outer membrane protein K，OMPK）；产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBL）
==== Refs
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