
==== Front
Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban
Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban
ZJYB
Journal of Zhejiang University (Medical Sciences)
1008-9292
《浙江大学学报》编辑部 杭州市天目山路148号浙江大学西溪校区浙江大学出版社415室

39034117
1008-9292(2024)04-0434-09
10.3724/zdxbyxb-2024-0148
2024-0148
R781.4
a
Monographic Reports
原代成骨细胞来源胞外囊泡促进破骨细胞分化
Effect of primary osteoblast-derived extracellular vesicles on osteoclast differentiationhttp://orcid.org/0009-0005-7306-9302
张 岚 ZHANG Lan 1
http://orcid.org/0000-0003-4207-6516
谭 静怡 TAN Jingyi 2
1 浙江医院口腔科，浙江 杭州 310030
1 Department of Stomatology, Zhejiang Hospital Hangzhou 310030 China
2 浙江大学医学院附属第二医院口腔内科，浙江 杭州 310009
2 Department of Stomatology, the Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine Hangzhou 310009 China
余 方
沈 敏
谭静怡，副主任医师，主要从事牙周病多学科联合治疗和牙周组织再生研究；E-mail：tanjingyi163@163.com；https：//orcid.org/0000-0003-4207-6516
TAN Jingyi, E-mail: tanjingyi163@163.com, https://orcid.org/0000-0003-4207-6516
张 岚，医师，主要从事牙周病发生发展机制研究和综合治疗；E-mail：21718177@zju.edu.cn；https：//orcid.org/0009-0005-7306-9302

25 8 2024
53 4 294 434442
18 4 2024
19 6 2024
2024
The Author(s)
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)
目的

观察原代成骨细胞来源胞外囊泡（OB-EV）对破骨细胞增殖、分化的作用，探究胞外囊泡参与成骨细胞和破骨细胞之间通信的可能分子机制。

方法

采用酶消化法分离原代成骨细胞，并以β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、地塞米松成骨诱导液诱导培养，通过碱性磷酸酶染色及茜素红S染色鉴定成骨细胞分化及矿化功能。收集成骨细胞培养上清液，采用超速离心法提取囊泡分泌物，并通过透射电镜观察囊泡形态，蛋白质印迹法鉴定胞外囊泡表面特征性标志物肿瘤易感基因101（TSG101）、ALG-2相互作用蛋白X（Alix）和分化抗原9（CD9）。采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）实验检测OB-EV对RAW264.7的增殖作用。进一步通过蛋白质印迹法检测OB-EV与核因子κB受体活化因子配体（RANKL）联合作用后RAW264.7破骨分化标志物的表达水平。将OB-EV处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMM）通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察并比较破骨细胞数，明确OB-EV对破骨细胞分化的影响。

结果

透射电镜观察提取的OB-EV呈直径为30~150 nm的双层杯状结构，且TSG101、Alix、CD9呈阳性表达。CCK-8实验结果显示高浓度（20 μg/mL以上）OB-EV抑制RAW264.7增殖（P<0.05）。蛋白质印迹法检测发现RAW264.7中c-Fos、活化T细胞核因子（NFATc1）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）等破骨细胞分化标志蛋白表达明显增加，且随OB-EV浓度增加而增加（P<0.05）。此外，将OB-EV与RANKL联合作用于BMM，结果显示TRAP阳性细胞较RANKL对照组显著增多（P<0.05）。

结论

OB-EV可促进破骨前体细胞向破骨细胞分化，但高浓度OB-EV会抑制细胞增殖。

Objective

To investigate the effect of osteoblast-derived extracellular vesicles (OB-EVs) on the proliferation and differentiation of osteoclasts, and to explore the possible molecular mechanism of extracellular vesicles involved in the communication between osteoblasts and osteoclasts.

Methods

Primary osteoblasts were isolated from newborn mouse calvarial bone and induced by β-glycero phosphate, ascorbic acid and dexamethasone. Osteogenic feature was tested by alkaline phosphatase (ALP) and alizarin red S staining. Extracellular vesicles were isolated by ultracentrifugation from the cell culture supernatant. Vesicle morphology was observed by transmission electron microscopy, and the characteristic markers of tumor susceptibility gene 101 (TSG101), ALG-2 interacting protein X (Alix) and cluster of differentiation 9 (CD9) on the surface of extracellular vesicles were identified by Western blotting. Cell counting kit 8 (CCK-8) assay was used to determine the proliferation effect of OB-EVs on mouse mononuclear macrophage RAW264.7 cells. Furthermore, the expression level of specific markers of osteoclast differentiation in RAW264.7 cells was detected by Western blotting after the combined effect of OB-EVs and receptor activator for nuclear factor κB ligand (RANKL). The number of osteoclasts was observed and compared with OB-EVs-treated mouse bone marrow-derived macrophages (BMMs) by tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining, and the effect of OB-EVs on osteoclast differentiation was determined.

Results

The extracted OB-EVs showed a double-layer cup-like structure with a diameter of 30-150 nm, and TSG101, Alix and CD9 were expressed. RAW264.7 cells were stimulated with OB-EVs, and the results of CCK-8 assay showed that high concentration of OB-EVs (more than 20 μg/mL) inhibited cell proliferation (P<0.05). Western blotting analysis showed that the expression of osteoclast differentiation marker proteins such as c-Fos, activated T cell nuclear factor (NFATc1) and c-Jun N-terminal kinase (JNK) in RAW264.7 cells were significantly increased, and the promoting effect was enhanced with increasing of OB-EVs concentration (P<0.05). In addition, the combination of OB-EVs and RANKL on BMMs showed that the number of TRAP-positive cells was significantly higher than that of the RANKL induction group alone (P<0.05).

Conclusion

OB-EVs can promote the differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts, but high concentration of OB-EVs can inhibit proliferation of RAW264.7 cells.

成骨细胞
胞外囊泡
破骨细胞
分化
小鼠
Osteoblast
Extracellular vesicles
Osteoclast
Differentiation
Mice
国家自然科学基金81800972
==== Body
pmc牙周炎是发生在牙齿支持组织，以牙周韧带及牙槽骨进行性破坏为特征的慢性感染性疾病。牙槽骨是人体骨骼系统中代谢和改建最活跃的，在生理状态下其吸收与改建维持动态平衡［1］。目前公认牙周炎由牙周致病菌与宿主免疫系统长期相互作用所致，牙周致病菌及其毒性产物与炎症因子等持续作用，引发宿主免疫失衡，最终导致牙周组织破坏、牙槽骨丧失，难以自然修复［2］。

在骨重建过程中，成骨细胞以多潜能间充质干细胞为主要来源，由前成骨细胞分化而成，在骨生成活跃的部位分泌胶原蛋白和非胶原蛋白等骨基质，随骨基质沉积，其合成功能逐渐降低，最终退化为骨细胞、骨衬里细胞［3］。破骨细胞是由来源于造血系统的单核-巨噬细胞融合而成的多核巨细胞。破骨细胞是目前发现唯一行使骨吸收功能的细胞，其主要功能是吸收钙化骨基质和降解有机基质［4］。在牙周炎进展过程中，成骨细胞和破骨细胞分别分泌不同的活性物质，如细胞因子、生长因子、趋化因子、miRNA等，通过旁分泌途径或直接接触方式进行交流，介导骨形成和骨吸收互相偶联、平衡的动态过程［2］。近年来，旁分泌途径的通信功能在牙周骨组织改建中逐渐得到关注。据报道，骨髓间充质干细胞分泌的胞外囊泡通过其包含的蛋白质、miRNA、酶等生物活性物质实现细胞间交流，参与骨代谢的调控［5-6］。研究发现，破骨细胞、成骨细胞、骨细胞等骨骼细胞分泌的胞外囊泡是骨组织通信网络中的关键元素，从成骨细胞中分离的胞外囊泡能够与其靶细胞融合以释放相关调节分子，介导靶细胞的重编程，从而影响正畸应力下的骨重塑进程［7］。

胞外囊泡是一种由细胞内多泡体与细胞膜融合并释放到细胞外基质中的膜囊泡，通过传输关键生物信息在免疫炎症反应中起重要作用［8-10］。在骨重建过程中，骨源性胞外囊泡可能会释放参与破骨细胞分化相关蛋白，如RANK和RANKL［11］。此外，在骨源性胞外囊泡中还发现了与骨改建相关的miRNA，后者在骨形成和吸收中起着至关重要的作用［11-12］。近年研究发现，基于OB-EV可能建立一种促进骨形成的正反馈机制。矿化的小鼠成骨细胞系MC3T3-E1来源的胞外囊泡能促进小鼠骨髓基质细胞ST2向成骨方向分化，表现为成骨标志物RUNX2和ALP的表达上调［13］。据报道，在成骨细胞外泌体中鉴定出的蛋白质分布于BMP-SMAD-RUNX、MAPK等多个骨信号通路中，参与各种骨发育和骨吸收过程［14］。最新研究表明，炎性破骨细胞分泌的外泌体通过肝配蛋白A2/EphA2特异性靶向成骨细胞，并富含长链非编码RNA LIOCE，与成骨转录因子Osterix相互作用后降低其泛素化水平，从而促进新骨形成［15］。

本研究通过提取乳鼠颅骨OB-EV，并根据MISEV2023指南进行表征［9］，以OB-EV联合RANKL干预作用于小鼠单核巨噬细胞RAW264.7和BMM，探索OB-EV对破骨前体细胞增殖及分化的作用机制，以期为牙槽骨重建提供新的治疗靶向。

1 材料与方法

1.1 动物、材料和仪器

出生24 h内的C57BL/6乳鼠10只、6~8周龄C57BL/6小鼠10只购自浙江中医药大学实验动物中心。本研究通过浙江大学医学院附属第二医院动物伦理委员会审查（2017-052），动物实验根据美国国立卫生研究院的实验动物护理和使用原则及程序进行。

小鼠单核巨噬细胞样白血病细胞RAW264.7购自上海酶研生物科技有限公司。所有细胞培养基为美国Gibco公司产品；BCA试剂盒、增强化学发光检测试剂盒为美国Thermo Fisher Scientific公司产品；β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、地塞米松、二甲基亚砜、TRAP试剂盒及CCK-8为德国Sigma-Aldrich公司产品；兔抗小鼠TSG101、兔抗小鼠CD9、兔抗小鼠Alix抗体为英国Abcam公司产品；兔抗小鼠β-actin、FOS、NFATc1、GAPDH抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗为武汉博士德生物工程有限公司产品；M-CSF和RANKL为美国R&D Systems公司产品。

倒置电子显微镜为日本Olympus公司产品；恒温细胞培养箱、台式离心机、低温高速离心机为德国Heraeus公司产品；超速离心机为美国Beckman公司产品；TRANS-BLOT半干转膜仪、SDS-PAGE电泳仪为美国Bio-Rad公司产品；超纯水仪（Mili-Q50型）为美国Millipore公司产品；电子天平（MP200A型）为上海第二天平衡器厂产品；透射电子显微镜为美国Thermo Scientific产品。

1.2 原代细胞的提取和培养

1.2.1 提取和诱导培养乳鼠颅骨成骨细胞

将脱颈处死出生24 h内的C57BL/6乳鼠头部分离并置于75%乙醇溶液中浸泡10 min后转至含1%青-链霉素双抗的PBS中，剥离颅骨骨片，用约10倍体积的0.25%胰蛋白酶于37 ℃、5%二氧化碳饱和湿度培养箱中消化20 min，每十分钟取出摇晃一次以消化纤维组织、血细胞、成纤维细胞等，以300×g离心5 min后弃上清液；将骨片用含1%青-链霉素双抗的PBS继续冲洗三次后放入H-DMEM完全培养基中，剪成颅骨碎片，放入细胞培养皿中均匀摊开，加入仅能覆盖骨片的H-DMEM；于37 ℃、5%二氧化碳饱和湿度的恒温培养箱中培养5~7 d。当培养皿内细胞爬至约80%融合后，进行常规消化传代；将细胞传至第三代时可进行细胞实验。

1.2.2 提取和培养小鼠BMM

参照文献［13］的方法，将C57BL/6雌性小鼠使用戊巴比妥钠（按150 mg/kg腹膜内注射）进行麻醉，并以颈椎脱位法实施安乐死。分离小鼠股骨和胫骨，用剪刀切开末端，使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素和30 ng/mL M-CSF的DMEM培养基冲洗长骨骨髓腔。将混合物均质化后置于培养皿中，于含5%二氧化碳的37 ℃恒温培养箱中孵育3 d，收集贴壁细胞作为BMM。

1.3 ALP染色和茜素红S染色鉴定细胞的成骨性能

将第三代成骨细胞接种于多孔细胞培养板，用含β-甘油磷酸钠、抗坏血酸和地塞米松的成骨培养基分别诱导7、21 d后，通过ALP染色和茜素红S染色鉴定成骨性能。

1.4 获取OB-EV

将第三代成骨细胞以4×105个/瓶密度接种于含H-DMEM完全培养基的T75细胞培养瓶中，待24 h细胞贴壁后，换用含成骨诱导液的H-DMEM完全培养基（10%去外泌体血清）继续培养，隔日换液，收集上清液并离心。以超速离心法获取上清液中的沉淀，用100 µL无菌PBS重悬，分装，－80 ℃保存。

1.5 透射电子显微镜表征OB-EV形态

对OB-EV进行负染色，将样品用蒸馏水稀释后放在铜格子上，用滤纸除去多余的液体，采用透射电子显微镜观察染色结果。

1.6 蛋白质印迹法检测OB-EV特征蛋白表达

采用BCA试剂盒对获取的OB-EV进行蛋白浓度定量。使用SDS-PAGE分离20 µg总蛋白，转移至0.2 µm孔径的聚偏二氟乙烯膜上，室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h，并在4 ℃冰箱中加入相应一抗孵育过夜。次日用1×TBST洗涤聚偏二氟乙烯膜后与二抗在室温下孵育1 h，化学发光检测试剂盒检测相应蛋白条带。成骨细胞裂解液作为阳性对照。

1.7 CCK-8法检测细胞增殖情况

选取生长状态良好的巨噬细胞在96孔板（5×103个/孔）中孵育24 h，用100 μL不同浓度的OB-EV（5、10、20、50 μg/mL）处理后继续培养，每天取出一块多孔细胞培养板，在相同的时间点将10 μL CCK-8溶液添加到孔中，随后在含5%二氧化碳的37 ℃恒温培养箱中孵育1.5 h。采用分光光度计在450 nm波长评估吸光度值。

1.8 蛋白质印迹法检测破骨细胞分化标志蛋白NFATc1、c-Fos、JNK表达

将RAW264.7以6×104个/孔的密度接种于12孔板，24 h后将细胞用30 ng/mL RANKL和不同浓度的OB-EV（0、1、5、10 µg/mL）处理4 d。隔日更换培养基，使用细胞裂解液提取细胞总蛋白后，用BCA试剂盒进行蛋白质浓度定量，随后以蛋白质印迹法检测破骨细胞标志物表达情况。

1.9 TRAP染色法检测成熟破骨细胞

将BMM以2×104个/孔的密度接种于24孔板，24 h后将细胞分别用含终浓度为20 ng/mL M-CSF（空白对照组）、20 ng/mL M-CSF+30 ng/mL RANKL（RANKL对照组）、10 µg/mL OB-EV+20 ng/mL M-CSF+30 ng/mL RANKL（OB-EV+RANKL组）的H-DMEM完全培养基处理5 d，隔日换液。倒置显微镜下观察到BMM形成多核细胞后，吸出培养基，用PBS洗涤，室温下4%多聚甲醛固定20 min，使用TRAP染液在37 ℃恒温孵箱中避光孵育1 h，PBS洗净后光学显微镜下观察细胞。体积大、胞浆呈紫红色，同时具有3个或3个以上细胞核的TRAP阳性细胞即为成熟破骨细胞［14］。

1.10 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件分析实验数据。实验均重复三次，正态分布计量数据以均数±标准差（ x¯ ±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐时采用最小显著差异法，方差不齐时采用Dunnett T3法，以P<0.05为差异有统计学意义。采用Graphpad Prism 8.0软件统计绘图。

2 结果

2.1 乳鼠颅骨原代成骨细胞的形态及成骨性能

原代细胞培养3 d后可见多角形、梭形贴壁细胞排列呈鱼鳞状，以骨片为中心向外周爬出，胞核呈椭圆或圆形，居中或偏向一侧，胞质丰富清晰。传代培养纯化的第三代细胞多呈短梭形、多边形，细胞间长突起互相接触、融合，呈铺路石状。见图1。提示从乳鼠颅骨分离的原代细胞具成骨细胞形态。

图1 乳鼠颅骨原代成骨细胞显微镜下形态

Figure 1 Morphology of primary osteoblasts isolated from newborn mouse calvarial bone

A：骨片周围见多角形原代细胞贴壁；B：传代培养至第三代的成骨细胞形态.标尺=200 μm.

ALP染色后肉眼可见板底细胞呈紫色深染（图2A、B）。经茜素红S染色后肉眼可见红色颗粒状、块状钙结节；倒置显微镜下可见细胞重叠生长，密度较高，细胞上附着大小不一的鲜红色钙结节，呈散点状或团状不均匀分布（图2C、D）。结果提示，从乳鼠颅骨分离出的原代细胞具有成骨性能，证实为原代成骨细胞。

图2 乳鼠颅骨原代成骨细胞ALP染色和茜素红S染色结果

Figure 2 ALP staining and alizarin red S staining of primary osteoblasts isolated from newborn mouse calvarial bone

ALP染色后肉眼（A右）和镜下（B右）均可见板底细胞呈紫色深染；茜素红S染色后肉眼（C右）和镜下（D右）均可见鲜红色钙结节，呈散点状或团状不均匀分布. 左图均为空白对照. 标尺=200 μm. ALP：碱性磷酸酶.

2.2 OB-EV的形态及特征蛋白表达

透射电子显微镜下观察发现OB-EV呈圆杯形双层膜泡结构，中间凹陷，直径30~150 nm，见图3。蛋白质印迹法检测结果显示，超速离心法获取的OB-EV特征性表达Alix、TSG101、CD9（图4），证实为胞外囊泡。提示通过超速离心法可成功提取OB-EV。

图3 透射电子显微镜下OB-EV的形态

Figure 3 Morphology of OB-EVs under transmission electron microscope

如箭头所示，OB-EV呈圆杯形双层膜泡结构，直径30~150 nm. 标尺=200 nm. OB-EV：成骨细胞来源胞外囊胞.

图4 OB-EV相关标志物蛋白电泳图

Figure 4 Electrophoretogram of markers in OB-EVs

OB-EV：成骨细胞来源胞外囊泡；Alix：ALG-2相互作用蛋白X；TSG：肿瘤易感基因；actin：肌动蛋白；CD：分化抗原.

2.3 OB-EV对RAW264.7活性的影响

CCK-8法结果显示，对RAW264.7增殖，5~10 μg/mL OB-EV无明显抑制作用；20 μg/mL OB-EV刺激48 h时开始有抑制作用，但随培养时间延长而减弱；50 μg/mL OB-EV具有显著抑制作用（P<0.05），见表1。提示低于10 μg/mL的OB-EV对细胞较为安全，因此选取浓度低于10 μg/mL的OB-EV进行破骨分化实验。

表1 不同浓度OB-EV作用不同时间RAW264.7存活率比较

Table 1 The viability of macrophage stimulated by different concentrations of OB-EVs

组 别	24 h	48 h	72 h	96 h	
空白对照组	0.753±0.120	1.071±0.035	1.190±0.108	1.374±0.103	
5 μg/mL OB-EV组	0.880±0.060	0.979±0.065	1.087±0.102	1.413±0.053	
10 μg/mL OB-EV组	1.019±0.034	1.126±0.006	1.233±0.041	1.409±0.026	
20 μg/mL OB-EV组	1.029±0.025	1.036±0.011	0.952±0.029	0.998±0.028*	
50 μg/mL OB-EV组	0.699±0.047	0.470±0.011	0.359±0.033	0.262±0.008*	
与空白对照组比较，* P<0.05. OB-EV：成骨细胞来源胞外囊泡.

x¯ ±s，n=3

2.4 OB-EV对RAW264.7破骨分化的影响

蛋白质印迹法结果显示，5、10 μg/mL OB-EV+RANKL组c-Fos、JNK和NFATc1表达水平较RANKL对照组升高（均P<0.05）；且10 μg/mL OB-EV+RANKL组c-Fos、JNK表达水平较1、5 μg/mL OB-EV+RANKL组也明显升高（均P<0.05），见图5和表2。提示5、10 μg/mL OB-EV可上调破骨细胞分化相关转录因子表达，从而促进破骨细胞分化，且这种作用与剂量有关。

图5 OB-EV联合RANKL作用破骨细胞NFATc1、c-Fos及JNK蛋白表达电泳图

Figure 5 Electrophoretogram of NFATc1， c-Fos and JNK proteins after treated with RANKL and OB-EVs

RANKL：核因子κB受体活化因子配体；OB-EV：成骨细胞来源胞外囊泡；NFATc：活化T细胞核因子；JNK：c-Jun氨基端激酶；GAPDH：磷酸甘油醛脱氢酶.

表2 OB-EV联合RANKL作用破骨细胞分化相关蛋白的表达量

Table 2 Expression of osteoclast related proteins after treated with RANKL and OB-EVs

组 别	NFATc1	c-Fos	JNK	
RANKL对照组	0.209±0.030	0.183±0.024	0.127±0.013	
1 μg/mL OB-EV+RANKL组	0.258±0.034	0.217±0.005	0.199±0.043	
5 μg/mL OB-EV+RANKL组	0.302±0.019*	0.226±0.023*	0.257±0.068*	
10 μg/mL OB-EV+RANKL组	0.322±0.023*	0.268±0.010*#△	0.331±0.011*#△	
与RANKL对照组比较，* P<0.05；与1 μg/mL OB-EV+RANKL组比较，# P<0.05；与5 μg/mL OB-EV+RANKL组比较，△ P<0.05. OB-EV：成骨细胞来源胞外囊泡；RANKL：核因子κB受体活化因子配体；NFATc：活化T细胞核因子；JNK：c-Jun氨基端激酶.

x¯ ±s，n=3

2.5 OB-EV对BMM破骨分化的影响

倒置显微镜下观察发现，RANKL对照组和OB-EV+RANKL组的BMM均能被诱导为多核、胞浆呈紫色深染的成熟破骨细胞，同时有胞浆呈紫色的单核破骨前体细胞；而空白对照组未观察到单核破骨前体细胞或成熟的多核破骨细胞，见图6。对TRAP染色阳性细胞计数并进行比较发现，OB-EV+RANKL组TRAP染色阳性细胞数（25.67±3.79）显著高于RANKL对照组（17.33±4.04，P<0.05）及空白对照组（0.67±0.58，P<0.05）。提示OB-EV能促进破骨细胞成熟。

图6 OB-EV处理骨髓来源巨噬细胞后TRAP染色结果

Figure 6 Tartrate-resistant acid phosphatase staining results of bone marrow-derived macrophages treated with OB-EVs

与空白对照组比较，RANKL对照组和OB-EV+RANKL组TARP阳性细胞数均增加（紫红色为TRAP表达阳性）. 标尺=500 μm. RANKL：核因子κB受体活化因子配体；OB-EV：成骨细胞来源胞外囊泡；TRAP：抗酒石酸酸性磷酸酶.

3 讨论

牙周炎是人类最常见的慢性感染性疾病，牙周炎导致的牙槽骨破坏致使牙齿生理功能减弱甚至丧失［1］。在生理状态下，人体免疫细胞、成骨细胞、破骨细胞和间充质细胞等通过细胞外因子、黏附分子和受体配体介导的信号通路进行细胞间的动态通信，介导了牙槽骨的重建及吸收［16］。各种病理因素引起的细胞间通信异常或中断都可能导致骨稳态失衡或严重的骨破坏［17］。近年来，旁分泌途径通信功能在牙周骨组织改建中受到关注，已有研究证实胞外囊泡在骨细胞之间的通信中发挥重要作用，胞外囊泡为治疗牙周炎和改善牙槽骨吸收提供了一条新途径［18］。Shen等［19］将牙髓干细胞衍生的外泌体掺入壳聚糖水凝胶，加速了牙周炎小鼠牙槽骨和牙周上皮的愈合，可有效治疗实验性牙周炎，其机制可能与外泌体包含的miR-1246促进牙周炎小鼠牙周组织中巨噬细胞从促炎表型向抗炎表型转变有关。

胞外囊泡是指机体内细胞通过胞吞作用形成多泡小体后，通过细胞膜融合分泌到细胞外环境中的微小囊泡，囊泡内包裹各种重要生物信息可被局部微环境中的靶细胞吸收或通过血液、体液转运至远端部位，是参与细胞间交流并调节细胞功能的重要通信介质［9］。研究表明，各种骨源性细胞分泌的胞外囊泡是调节骨重塑的活性成分的载体，是成骨细胞-破骨细胞交流的新途径［20］。近年有体内研究发现，成熟的成骨细胞分泌并捕获细胞外小泡，称为SOV，其通过抑制骨形成并促进破骨细胞生成，控制体内从骨形成到骨吸收阶段的动态转变过程。共培养实验表明，SOV抑制成骨细胞分化，增强RANKL表达，从而诱导破骨细胞分化，这为基于胞外囊泡观察体内成骨破骨稳态平衡提供了一个新视角［21］。本研究分离了乳鼠颅骨原代成骨细胞，用地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸将其诱导为矿化成骨细胞，经ALP染色、茜素红S染色鉴定了该成骨细胞具有矿化功能。随后采用Ge等［14］报道的超速离心法提取了OB-EV，通过透射电子显微镜和蛋白质印迹法对胞外囊泡进行鉴定。

目前，骨稳态研究中已建立多种破骨细胞分化模型，常见的有RAW264.7、BMM等。RAW264.7是单核巨噬细胞样细胞，源自BALB/c小鼠的Abelson白血病病毒转化细胞系［22］。由于RAW264.7在RANKL诱导下可分化成破骨细胞，并且易于获取和培养，因此成为研究破骨细胞分化和活性的常用模型。BMM是小鼠骨髓中提取的原代细胞，其性状和功能更贴近机体本身的巨噬细胞，由于每次实验现用现提，避免了实验室祖传细胞株培养变异的弊端，实验结果更加稳定可靠［23］。但由于原代细胞提取过程相对烦琐，操作具有一定难度，诱导周期较长且无法增殖，无法满足蛋白提取实验所需。因此，本研究在TRAP染色实验中使用BMM，而在蛋白质印迹法中使用RAW264.7。据Song等［24］报道，以6.25×103/cm2密度接种RAW264.7，30 ng/mL RANKL刺激5 d后多核破骨细胞数显著增多。以往研究显示，大鼠上颌骨骨髓间充质干细胞来源的外泌体会被靶细胞RAW264.7特异性摄取，进而促进RAW264.7中破骨细胞生成［25］。因此，本研究选用RAW264.7，以不同浓度的胞外囊泡进行刺激，通过CCK-8法检测RAW264.7的增殖活性，发现20 μg/mL以上浓度的胞外囊泡对RAW264.7增殖有抑制作用，随浓度升高抑制作用增强。由于胞外囊泡携带的生物信息复杂多样，并富含有生长因子，如转化生长因子-β、胰岛素样生长因子和成纤维细胞生长因子，研究发现这些生长因子可能通过介导细胞中的Akt和ERK磷酸化，抑制牙周韧带细胞迁移和增殖［26］。Meng等［27］发现，人间充质干细胞来源的胞外囊泡能够通过miR-124a抑制成纤维样滑膜细胞的迁移并促进细胞凋亡。因此推测胞外囊泡中包含的某种生物活性物质抑制了细胞增殖，但其机制仍需进一步探索。

破骨前体细胞的分化首先由髓系祖细胞通过PU.1和Mitf诱导表达的M-CSF受体促进RANK表达，从而激活NF-κB、JNK、ERK和p38等信号通路，共同调控破骨前体细胞分化过程［28］。破骨前体细胞响应RANKL的最早表现之一是NFATc1启动子招募RelA/p50和NFATc2，随后通过TRAF6/NF-κB和CCAAT/增强子结合蛋白α被c-Fos激活，以发出激活信号促使破骨前体细胞分化和随后的破骨细胞活化［29］。有学者发现miR-21在破骨细胞分化过程中被上调，并通过靶向PTEN基因激活PI3K/Akt信号通路促进破骨细胞分化和骨吸收功能［30］。而c-Fos可通过上调miR-21降低PDCD4蛋白表达，从而抵消c-Fos在破骨细胞生成过程中的抑制作用，形成调控破骨细胞生成的c-Fos/miR-21/PDCD4的正反馈回路［31］。由此受到启发，本研究以不同浓度胞外囊泡和30 ng/mL RANKL共同诱导巨噬细胞，通过蛋白质印迹法测定细胞NFATc1、c-Fos、JNK蛋白表达，进一步观察胞外囊泡对破骨细胞分化的作用。结果显示，OB-EV+RANKL组NFATc1、c-Fos、JNK表达较RANKL对照组均增高，且随胞外囊泡浓度增加呈逐渐升高趋势。NFATc1、c-Fos、JNK的高表达意味着胞外囊泡具有促进破骨细胞早期分化的作用。随后将胞外囊泡联合RANKL培养BMM，5 d后经TRAP染色发现其诱导形成的破骨细胞数比RANKL对照组增多，进一步验证了胞外囊泡可促进破骨细胞分化形成的假设。由此推测胞外囊泡可能通过释放miRNA等通信物质参与调节破骨细胞分化过程，但其具体作用通路需要更进一步的分子机制研究。

综上所述，除经典信号通路外，原代成骨细胞能通过分泌胞外囊泡间接作用于RAW264.7，上调早期破骨分化相关的NFATc1、c-Fos、JNK表达，参与调节破骨细胞分化，并且促进BMM分化为成熟破骨细胞，而OB-EV高浓度下可抑制细胞增殖。本研究结果验证了以下假设：胞外囊泡是成骨细胞与破骨细胞之间的重要通信介质，来自成骨细胞的胞外囊泡直接影响破骨细胞的分化。成骨细胞和破骨细胞之间通过胞外囊泡介导的细胞间通信代表了一种新的骨细胞信号传导方式，有助于阐明牙槽骨稳态失衡的机制。然而，其中潜在的作用通路及机制仍需继续探讨，同时采用动物模型等体内研究进一步验证，以期为牙周疾病的临床治疗提供一种新思路。

研究得到国家自然科学基金（81800972）支持

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81800972)

利益冲突声明

所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of Interests

The authors declare that there is no conflict of interests

［缩略语］

微RNA（microRNA，miRNA，miR）；核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）；NF-κB受体活化因子（receptor activator for NF-κB，RANK）；RANK配体（RANK ligand，RANKL）；成骨细胞来源胞外囊泡（osteoblast-derived extracellular vesicles，OB-EV）；Runt相关转录因子（Runt-related transcription factor，RUNX）；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）；骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）；丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）；细胞计数试剂盒（cell counting kit，CCK）；肿瘤易感基因（tumor susceptibility gene，TSG）；分化抗原（cluster of differentiation，CD）；ALG-2相互作用蛋白X（ALG-2 interacting protein X，Alix）；活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cell，NFATc）；磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）；巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）；骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophage，BMM）；含吐温-20的Tris缓冲液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）；c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）；小成骨细胞囊泡（small osteoblast vesicles，SOV）；蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）；细胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）；泛素连接酶（TNF receptor associated factor，TRAF）；磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）；程序性细胞死亡因子（programmed cell death，PDCD）
==== Refs
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