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Rev Bras Ortop (Sao Paulo)
Rev Bras Ortop (Sao Paulo)
10.1055/s-00042410
Revista Brasileira de Ortopedia
0102-3616
1982-4378
Thieme Revinter Publicações Ltda. Rua do Matoso 170, Rio de Janeiro, RJ, CEP 20270-135, Brazil

10.1055/s-0044-1787768
RBO-D-23-00268
Artigo Original
Básica
Histomorphometric Study of Non-critical Bone Defect Repair after Implantation of Magnesium-substituted Hydroxyapatite Microspheres
http://orcid.org/0009-0003-6859-5522
Silva Jacqueline de Azerêdo 1
http://orcid.org/0000-0001-8601-5825
Santos George Gonçalves dos 2
http://orcid.org/0000-0002-9602-1708
Ribeiro Iorrana Índira dos Anjos 3
http://orcid.org/0000-0003-0581-1438
Silva Ana Maria Guerreiro Braga da 4
http://orcid.org/0000-0003-2663-7395
Barreto Isabela Cerqueira 5
http://orcid.org/0000-0002-3592-986X
Matos Marcos Almeida 6
http://orcid.org/0000-0001-5608-2058
Barreto Maurício Andrade 6
http://orcid.org/0000-0002-0607-0208
Miguel Fúlvio Borges 5
1 Centro de Medicina Hiperbárica do Nordeste (CMHN), Salvador, BA, Brasil
2 Centro de Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB), Santo Antônio de Jesus, BA, Brasil
3 Programa de Pós-Graduação em Processos Interativos dos Órgãos e Sistemas (PPGPIOS), Faculdade Adventista da Bahia (FADBA), Cachoeira, BA, Brasil
4 Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas (CCAAB), Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB), Cruz das Almas, BA, Brasil
5 Instituto de Ciências da Saúde (ICS), Universidade Federal da Bahia (UFBA), Salvador, BA, Brasil
6 Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública (EBMSP), Salvador, BA, Brasil
Endereço para correspondência Iorrana Índira dos Anjos Ribeiro Programa de Pós-graduação em Processos Interativos dos Órgãos e Sistemas (PPGPIOS), Faculdade Adventista da BahiaRua Joaquim Ferreira 967, 505B, Jardim das Margaridas, Salvador, BACEP 41502-200indiraanjos@gmail.com
04 9 2024
8 2024
1 9 2024
59 4 e519e525
04 10 2023
05 4 2024
The Author(s). This is an open access article published by Thieme under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License, permitting copying and reproduction so long as the original work is given appropriate credit ( https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ )
2024
The Author(s).
https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Objective  The present study aims to analyze histomorphometrically the repair of a non-critical bone defect after implantation of hydroxyapatite (HA) microspheres substituted by magnesium (Mg).

Methods  Thirty rats were distributed into 3 experimental groups, evaluated at 15 and 45 days postoperatively: HAG (bone defect filled with HA microspheres); HAMgG (bone defect filled with HA microspheres replaced with 1 mol% Mg), and CG (bone defect without implantation of biomaterials).

Results  After 15 days, the biomaterials filled the entire defect extent, forming a new osteoid matrix between the microspheres. In the CG, this neoformation was restricted to the edges with the deposition of loose connective tissue with reduced thickness. At 45 days, new bone formation filled almost the entire extension of the bone defect in the 3 groups, with statistically significant osteoid deposition in the CG despite the reduced thickness compared with the HAG and HAMgG. The groups with biomaterial implantation displayed a more abundant osteoid matrix than at 15 days.

Conclusion  The biomaterials studied showed biocompatibility, osteoconductivity, and bioactivity. The Mg concentration in the substituted HA did not stimulate more significant bone formation than HA without this ion.

Keywords

biomaterials
bone and bones
bone regeneration
hydroxyapatite
magnesium
Suporte Financeiro Os autores declaram que não receberam suporte financeiro de agências dos setores público, privado, ou sem fins lucrativos para a realização deste estudo. Financial Support The authors declare that they have not received financial support from agencies in the public, private, or non-profit sectors to conduct the present study.
==== Body
pmcIntroduction

Bone tissue bioengineering, an emerging, interdisciplinary, and multidisciplinary area, has gained prominence in recent years due to the technical-scientific advances achieved and the increasingly growing biomedical and socioeconomic demands in today's society. Researchers in this area have applied the principles of biological and health sciences, chemistry, physics, and engineering to developing and improving regenerative techniques and biomaterials capable of restoring or improving the function and aesthetics of compromised tissues and organs. 1 2 3 4

To define the applicability of these biomaterials, they shall present physical-chemical, biological, and morphological properties similar and compatible with living tissues to act as three-dimensional (3D) scaffolds assisting tissue regeneration or working as suitable replacements for damaged or lost tissues and organs. Among the various biomaterials currently available, calcium phosphate bioceramics (CaP) represent a widely researched and used class in bone regenerative techniques. 1 Among these materials, synthetic hydroxyapatite (HA) has stood out in recent decades due to its biocompatibility, similarity with biological apatite, bioactivity, osteoconductivity, non-immunogenicity, and enabling cellular events observed during tissue regeneration, such as angiogenesis and osteogenesis. 1 2 3 4 However, this ceramic presents slow biodegradation and bioresorption rates after in vivo implantation, asynchronous to the bone regeneration mechanism. 1 2 3 4 Furthermore, it is a rigid and brittle material, which can remain in the implantation site for months and even years, depending on the synthesis and processing method. 4 5

Given this, one of the main objectives of researchers in this area has been to improve the properties of synthetic HA and modify the characteristics of this material to enhance the tissue response after in vivo implantation. Among the different methods available to carry out these modifications, HA-hexagonal-structure isomorphic substitutions have shown satisfactory results 3 6 due to the effects on the physical properties of the material, observed by changes in network parameters, crystalline structure, morphology, solubility, and thermal stability compared to unsubstituted HA. 7

In these cases, other metals, such as zinc (Zn), strontium (Sr), fluorine (F), manganese (Mn), and magnesium (Mg), can replace calcium (Ca). 3 4 6 Magnesium has attracted great scientific interest, considering that, among other properties, it participates in the homeostasis of bone tissue and, together with other minerals, is fundamental to the mechanism of bone regeneration, stimulating bone formation, through the activation of osteoblasts and inhibiting resorption, through action on osteoclasts. 8 9 10 11

Despite these possibilities, the physicochemical properties, biological behavior, and regenerative capacity of CaP substituted with Mg still require further studies to ensure the effectiveness of the techniques used during the synthesis and processing of these biomaterials. Therefore, this study evaluated the repair of non-critical bone defects after implantation of Mg-substituted HA microspheres in the rats' calvaria.

Materials and Methods

Biomaterials

The biomaterials evaluated in this study have been synthesized, processed, and sterilized in the Biomaterials Laboratory (LABIOMAT, in the Portuguese acronym) of the Brazilian Center for Physical Research (Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas, CBPF). The synthesis, processing, and characterization are described in Santos et al. 4

Surgical Procedures

This study was performed in the bioterium of Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) after approval by the Ethics Committee on Animal Use (CEUA, in the Portuguese acronym) of Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública, protocol 02/2013. Thirty adults male Wistar rats, with body weight between 350 and 400g, were randomly distributed to form 3 experimental groups, with 5 animals each: HAG (defect filled with HA microspheres group); HAMgG (bone defect filled with MgHA microspheres group), CG – control group (bone defect without biomaterial), evaluated 15 and 45 days after surgery. The surgical technique used was the same as described by Miguel et al. 12 and illustrated by Santos et al. 2 However, it is worth highlighting that in these studies, the bone defect was approximately 8.0 mm in diameter, while in this study, it was about 5.0 mm 13 ( Fig. 1 ).

Fig. 1 Surgical steps for creating a non-critical bone defect. ( A ) Calvarial region after trichotomy and antisepsis; ( B ) flap reflected after a semilunar bi-coronal skin incision to expose the bone tissue; ( C ) demarcation of the bone defect in the median portion of the calvaria; and ( D ) non-critical bone defect created.

Histological Processing and Histomorphological Analysis

At the biological points of 15 and 45 days, the animals have been euthanized with a lethal ketamine and xylazine dose. Then, the upper portion of the calvaria was removed, the soft tissues were discarded, and the specimens were fixed in 4% buffered formaldehyde for 7 days. After this step, they were decalcified in 5% nitric acid for 2 hours, embedded in paraffin, and cut into 5.0-µm thick slices. The histological sections obtained were stained with hematoxylin-eosin (HE) and subsequently examined by standard light microscopy (DM1000–Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) for histomorphological and morphometric analysis. A digital camera (DFC 310 FX – Leica Camera AG, Wetzlar, Germany) coupled to a standard light microscope (DM1000–Leica) and the software QWin 3.1 (Leica) measured the area of the newly formed mineralized matrix in the 3 experimental groups. Subsequently, statistical analysis was carried out based on the mean and standard deviation to obtain the p -value, with a significance level of 5% ( p  < 0.05), using the analysis of variance (ANOVA).

Results

Histomorphological Analysis

At 15 days, in the HAG, neoformation of an osteoid matrix was observed associated with the bone edges and surrounding some microspheres, which were predominantly organized in a monolayer and occupied the entire extension of the bone defect, maintaining the thickness proportional to the edges ( Fig. 2A ). Active osteocytes and osteoblasts were observed associated with this matrix. The formation of connective tissue and mild chronic inflammation with mononuclear inflammatory infiltrate and multinucleated giant cells, mainly around the microspheres, was noted between the mineralized areas and the microspheres ( Fig. 2B ).

Fig. 2 Photomicrograph of HAG – 15 and 45 days. Note microspheres (M) distributed in a mono or double layer, with the formation of an osteoid matrix (*), in almost the entire extension of the defect, with the presence of osteocytes (OCs) and organized in concentric bone lamellae; loose connective tissue (CT) in the residual area of the bone defect, with the presence of mononuclear inflammatory cells (Ci) and multinucleated giant cells (yellow arrow). Abbreviations: Be, bone edge; HE, hematoxylin and eosin. 15 days ( A , B ). 45 days ( C , D ).

At the biological point of 45 days, the microspheres in the HAG were mainly distributed in multilayers. The newly formed osteoid matrix was more evident than at 15 days and filled, on average, 4/5 of the bone defect in a centripetal direction, surrounded by the biomaterial ( Fig. 2C ). The microspheres near the edges were surrounded by the newly formed osteoid matrix, with many active osteoblasts, osteocytes, and some concentric lamellae ( Fig. 2D ). In the residual area, the formation of connective tissue with a denser appearance than the previous biological point was noted, with the presence of blood vessels and a mild chronic granulomatous inflammatory response.

In the HAMgG, at 15 days, with the biomaterials, neoformation of the osteoid matrix was noted in a centripetal direction, more evident in the peripheral region of the defect ( Fig. 3A ). Like HA, the biomaterials filled the entire bone defect, with a thickness proportional to the edges, and arranged in a monolayer. Active osteoblasts and numerous osteocytes were observed in association with the osteoid matrix. The remaining areas were filled with loose connective tissue full of blood vessels ( Fig. 3B ) and chronic granulomatous inflammatory infiltrate of moderate appearance, mainly surrounding the microspheres.

Fig. 3 Photomicrograph of HAMgG – 15 days and 45 days. Microspheres (M) are observed distributed in a monolayer, permeated by a newly formed osteoid matrix (*), in a centripetal direction, and by connective tissue (CT), rich in blood vessels (black arrow). Abbreviations: Be, bone edge; V, central vein; HE, hematoxylin and eosin. 15 days ( A , B ). 45 days ( C , D ).

At the biological point of 45 days, in the HAMgG, the new bone formation permeated by the microspheres extended centripetally and confluently, filling approximately 2/3 of the linear extension of the defect ( Fig. 3C ). Furthermore, it was noted that the microspheres located close to the edges were surrounded by osteoid neoformation rich in osteocytes. In the residual area, there was a new formation of connective tissue, more organized than at 15 days, and a large number of blood capillaries ( Fig. 3D ).

The CG, at 15 days, displayed bone neoformation with a reactional appearance associated with the edges, presenting active osteoblasts and osteocytes. The remaining area showed deposition of loose connective tissue, with reduced thickness, abundant in spindle cells and blood vessels ( Fig. 4A ). At 45 days, new bone formation extended beyond the edge in a centripetal direction, more evidently than at 15 days ( Fig. 4B ). The chronic inflammation observed was discreet and scarce. Tissue repair was completed with the formation of connective tissue in the region and no mineralization.

Fig. 4 Photomicrograph of CG – 15 and 45 days. Note the neoformation of the osteoid matrix (*) in a centripetal direction, with reduced thickness about the bone edges (Be), with a residual area filled with connective tissue (CT). HE, hematoxylin and eosin. 15 days ( A ) and 45 days ( B ).

Histomorphometric Analysis

The histomorphometric study displayed no statistically significant differences among the three groups evaluated at 15 days when analyzing the newly formed osteoid matrix area. At the biological point of 45 days, statistical significance was noted when comparing the HAMgG and HAG with the CG, with the latter group having a higher average of newly formed osteoid matrix ( Table 1 ).

Table 1 Percentage of the newly formed mineralized area in relation to the total area of the defect at the 15- and 45-days biological points, in the 3 experimental groups

Group
Period	HAMgG	HAG	CG	P-value (between-group)	Comparison HAMgG x HAG	Comparison of CG with HAMgG and HAG	
15 days	25% (±29)	12% (±7)	20% (±38)	p  = 0.58 NS	p  = 0.55 NS	HAMgG: p  = 0.89 NS
HAG: p  = 0.82 NS	
45 days	20% (±13)	25% (±11)	61% (±21)	p  = 0.01 S	p =  0.92 NS	HAMgG: p  = 0.01 S
HAG: p  = 0.02 S	
Abbreviations: CG, control group; HAG, group with defect filled with hydroxyapatite microspheres; HAMgG, group with bone defect filled with magnesium-substituted hydroxyapatite microspheres group; NS, not statistically significant; S, statistically significant.

Discussion

Experimental models in vivo have been referenced for many decades in different types of studies in various knowledge areas. To evaluate biomaterials designed for bone regeneration, these models must present anatomical and physiological characteristics that enable an understanding of natural phenomena to determine the osteogenic potential of the materials investigated. Thus, among the different possibilities for studies, the bone defect created in the calvaria of a rat stands out, which presents easy access and surgical manipulation, low cost, good predictability, and reproducibility. 14 Therefore, this study evaluated the repair of non-critical bone defects after implantation of HA microspheres substituted with Mg.

The surgical procedure to create this defect promoted tissue damage and, consequently, vascular rupture that resulted in blood leakage and clot formation, followed by release of cytokines that triggered an inflammatory response. This inflammation, chronic granulomatous, discrete, and regressive throughout the study, agreed with what occurs when a biomaterial is implanted in vivo . 15 16 These findings are in line with what was observed by Santos et al . , 2 Santos et al., 4 Miguel et al . , 12 Daltro et al., 13 Almeida et al. 17 and Ribeiro et al. 18 These authors evaluated different types of biomaterials for bone regeneration, in rat calvaria, and described the same tissue response.

During the physiological events that occur in bone regeneration, besides the release of cytokines and chemical mediators, there is the secretion of growth, cellular differentiation, and angiogenic factors, which stimulate the formation of connective tissue rich in new blood vessels, with consequent development of granulation tissue, as well as deposition of the osteoid matrix, which subsequently becomes mineralized. At all biological points, such histomorphological characteristics were observed in the three groups evaluated in our study. At 45 days, in the CG, the neoformation of mineralized tissue was approximately 60%. However, in HAG and HAMgG this percentage was 25 and 20%, respectively. This difference in bone neoformation in the two groups with biomaterial implantation, as compared to the CG, derives from the presence of microspheres in the bone defect since these were sintered and, consequently, not reabsorbed due to the sintering of the material – a procedure that promotes changes in the HA crystal lattice with crystal fusion. 19 Thus, in HAG and HAMgG, the microspheres occupied a large part of the sectional area of the defect and, thus, formed a three-dimensional framework throughout the linear extension and height of the bone defect.

It is worth highlighting that although some authors suggest and defend some methodologies as standard, there is still no consensus in the literature on which bone defect exact diameter shall be considered non-critical or critical. A “critical” bone defect has been defined as a bone defect that does not regenerate throughout the life of the animal 20 or of the study. 21 In these cases, the repair is completed by fibrosis, and new bone formation is restricted to the edges. 4 12 17 18 This situation was not observed in the present study, in which new mineralized tissue formed centripetally along the biological points, with regeneration of almost the entire defect area in the CG at 45 days. These findings contrast with the results obtained by authors who classify this 5.0-mm bone defect as critical. 22 23 24

Concerning bone regeneration, a 3D scaffold is essential for the cellular and vascular events observed during this mechanism. Therefore, ceramic biomaterials have been widely studied for this purpose in different forms of presentation and composition. Scientific and technological advances experienced in recent decades have increasingly enabled the development of materials with biomimetic physicochemical characteristics to stimulate new bone formation. Among these materials, HA has been extensively researched due to its biocompatibility, similarity with natural components of the mineral phase of bone tissue, osteoconductivity, bioactivity, 1 3 and lack of toxicity and immunogenicity. Our study observed such characteristics in the two groups in which biomaterials were implanted, in the three biological points, which allowed the formation of an osteoid matrix and connective tissue between and surrounding the microspheres.

The HA hexagonal structure performs ionic exchanges at the Ca 2+ and HPO 4 3− sites with elements or functional groups that are naturally part of the bone composition to promote changes in crystallinity, solubility, biodegradation, and, consequently, in biological properties of the biomaterial after in vivo implantation. 4 25 26 Mg stands out, playing a critical role in bone metabolism and growth: the deficiency of this element inhibits the osteoblasts' activity, favoring the osteoclasts' survival and performance. 27 28 Furthermore, the presence of Mg contributes to biomineralization, mainly in the initial phase of osteogenesis: it increases the kinetics of HA nucleation, delays its crystallization, and can interfere with qualitative changes in the bone matrix. 29 This is probably why the average bone formation at 15 days was higher in HAMgG compared to HAG, however, without statistically significant differences. Despite this, this pattern did not repeat after 45 days, and the average osteoid matrix formation was similar between these groups.

Mg also has an essential effect on promoting angiogenesis, stimulating endothelial cells, and the production of vascular growth factors, 30 which may justify the presence of more evident blood vessels in HAMgG than in the other groups throughout the study. Furthermore, incorporating this metal into the HA structure promoted a slight decrease in the biomaterial crystallinity without hampering the ceramic biodegradation, probably due to sintering.

The biocompatibility and bioactivity of the biomaterials studied here demonstrate that these materials have future clinical applications, especially as filler biomaterials. Given the results obtained in this work, new studies shall analyze these biomaterials without heat treatment (sintering) and with other variations in Mg concentration in critical (8.0 mm) and non-critical defects (5.0 mm) to better characterize the osteogenic potential of these ceramics replaced with this metal.

Conclusions

The biomaterials evaluated in this study are biocompatible, osteoconductive, and bioactive. The Mg substituted in HA stimulated a higher bone formation only in the initial phase of bone repair (15 days), forming the osteoid matrix similarly between ceramics in the final stage of the study.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Silvia Rachel de Albuquerque Santos e ao pesquisador Alexandre Malta Rossi do Laboratório de Biomateriais (LABIOMAT) do Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas (CBPF) pela concessão dos biomateriais avaliados neste estudo.

Acknowledgments

The authors would like to thank Silvia Rachel de Albuquerque Santos and researcher Alexandre Malta Rossi from the Biomaterials Laboratory (LABIOMAT) of the Brazilian Center for Physical Research (CBPF) for granting the biomaterials evaluated in this study.

Contribuições dos Autores

Authors' Contributions

Estudo histomorfométrico do reparo de defeito ósseo não crítico após implantação de microesferas de hidroxiapatita com substituição por magnésio
Resumo

Objetivo  O presente estudo teve como objetivo fazer uma análise histomorfométrica do reparo de um defeito ósseo não crítico após a implantação de microesferas de hidroxiapatita (HA) com substituição por magnésio (Mg).

Métodos  Trinta ratos foram distribuídos em 3 grupos experimentais, avaliados aos 15 e 45 dias após a cirurgia: GHA (defeito ósseo preenchido com microesferas de HA); GHAMg (defeito ósseo preenchido com microesferas de HA com substituição por 1 mol% de Mg) e GC (defeito ósseo sem implantação de biomateriais).

Resultados  Aos 15 dias, evidenciou-se que os biomateriais preencheram toda a extensão do defeito, com neoformação de matriz osteoide de permeio às microesferas. No GC, essa neoformação ficou restrita às bordas, com deposição de tecido conjuntivo frouxo de espessura reduzida. Aos 45 dias, a neoformação óssea preencheu quase toda a extensão do defeito ósseo nos 3 grupos, com deposição osteoide estatisticamente significativa no GC, apesar da espessura reduzida em comparação ao GHA e o GHAMg. Os grupos com implantação de biomaterial apresentaram matriz osteoide mais abundante do que aos 15 dias.

Conclusão  Os biomateriais estudados apresentaram biocompatibilidade, osteocondutividade e bioatividade. A concentração de Mg na HA com substituição não estimulou a formação óssea mais significativa do que a HA sem este íon.

Palavras-chave

biomateriais
hidroxiapatitas
magnésio
osso e ossos
regeneração óssea
Introdução

A bioengenharia tecidual óssea, área emergente, interdisciplinar e multidisciplinar, tem ganhado destaque nos últimos anos devido aos avanços técnico-científicos alcançados e as crescentes demandas biomédicas e socioeconômicas da sociedade atual. Os investigadores desta área têm aplicado os princípios das ciências biológicas e da saúde, da química, da física e da engenharia para desenvolver e melhorar técnicas regenerativas e biomateriais capazes de restaurar ou melhorar a função e a estética de tecidos e órgãos comprometidos. 1 2 3 4

A aplicabilidade desses biomateriais é definida pela presença de propriedades físico-químicas, biológicas e morfológicas semelhantes e compatíveis com tecidos vivos para atuarem como arcabouços tridimensionais (3D), que auxiliem a regeneração tecidual ou, ainda, atuem como substitutos adequados de tecidos e órgãos danificados ou perdidos. Dentre os diversos biomateriais hoje disponíveis, as biocerâmicas de fosfato de cálcio (CaP) representam uma classe amplamente pesquisada e utilizada em técnicas de regeneração óssea. 1 Dentre esses materiais, a hidroxiapatita (HA) sintética tem se destacado nas últimas décadas devido à sua biocompatibilidade, semelhança com a apatita biológica, bioatividade, osteocondutividade, não imunogenicidade e eventos celulares facilitadores observados durante a regeneração tecidual, como angiogênese e osteogênese. 1 2 3 4 No entanto, esta cerâmica apresenta baixas taxas de biodegradação e bioabsorção após a implantação in vivo , assíncronas em relação ao mecanismo de regeneração óssea. 1 2 3 4 Além disso, é um material rígido e quebradiço, que pode permanecer no sítio de implantação por meses e até anos, dependendo do método de síntese e processamento. 4 5

Diante disso, um dos principais objetivos dos pesquisadores nesta área tem sido melhorar as propriedades da HA sintética e modificar as características deste material para potencializar a resposta tecidual após a implantação in vivo . Dentre os diferentes métodos disponíveis para realizar essas modificações, as substituições isomórficas da estrutura hexagonal da HA têm apresentado resultados satisfatórios 3 6 devido aos efeitos nas propriedades físicas do material, observados por alterações nos parâmetros de rede, estrutura cristalina, morfologia, solubilidade e estabilidade térmica em comparação à HA sem substituição. 7

Nestes casos, outros metais, como o zinco (Zn), estrôncio (Sr), flúor (F), manganês (Mn) e magnésio (Mg), podem substituir o cálcio (Ca). 3 4 6 O magnésio (Mg) tem despertado grande interesse científico, visto que, entre outras propriedades, participa da homeostase do tecido ósseo. Além disso, juntamente com outros minerais, é fundamental para o mecanismo de regeneração óssea, pois estimula a formação óssea por meio da ativação de osteoblastos, e inibe a reabsorção por sua ação sobre os osteoclastos. 8 9 10 11

Apesar dessas possibilidades, as propriedades físico-químicas, o comportamento biológico e a capacidade regenerativa do CaP substituído por Mg ainda necessitam de mais estudos para assegurar a eficácia das técnicas utilizadas durante a síntese e processamento desses biomateriais. Portanto, este estudo avaliou o reparo de defeitos ósseos não críticos após a implantação de microesferas de HA com substituição por Mg na calvária de ratos.

Materiais e Métodos

Biomateriais

Os biomateriais avaliados neste estudo foram sintetizados, processados e esterilizados no Laboratório de Biomateriais (LABIOMAT) do Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas (CBPF). Sua síntese, processamento e caracterização foram descritos por Santos et al. 4

Procedimentos Cirúrgicos

Este estudo foi realizado no biotério da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) após aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública, protocolo 02/2013. Trinta ratos Wistar adultos, machos, com peso corporal entre 350 e 400 g, foram distribuídos aleatoriamente em 3 grupos experimentais com 5 animais cada: GHA (grupo com defeito preenchido com microesferas de HA); GHAMg (grupo com defeito ósseo preenchido com microesferas de MgHA) e GC (grupo controle com defeito ósseo sem implante de biomaterial). Os animais foram avaliados 15 e 45 dias após a cirurgia. A técnica cirúrgica utilizada foi a mesma descrita por Miguel et al. 12 e ilustrada por Santos et al. 2 Porém, vale ressaltar que, nestes estudos, o defeito ósseo tinha aproximadamente 8,0 mm de diâmetro, mas aqui tinha cerca de 5,0 mm 13 ( Fig. 1 ).

Fig. 1 Etapas cirúrgicas para criação de um defeito ósseo não crítico. ( A ) Região da calvária após tricotomia e antissepsia; ( B ) retalho rebatido após incisão semilunar bicoronal na pele para exposição do tecido ósseo; ( C ) demarcação do defeito ósseo na porção mediana da calvária; e ( D ) defeito ósseo não crítico criado.

Processamento Histológico e Análise Histomorfológica

Nos pontos biológicos de 15 e 45 dias, os animais foram eutanasiados com dose letal de cetamina e xilazina. Em seguida, a porção superior da calvária foi removida, os tecidos moles foram descartados e os espécimes foram fixados em formaldeído tamponado a 4% por 7 dias. Após esta etapa, foram descalcificados em ácido nítrico 5% por 2 horas, embebidos em parafina e cortados com 5,0 μm de espessura. Os cortes histológicos obtidos foram corados com hematoxilina-eosina (HE) e posteriormente examinados em microscopia óptica padrão (DM1000–Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) para análise histomorfológica e morfométrica. Uma câmera digital (DFC 310 FX – Leica Camera AG, Wetzlar, Alemanha) acoplada a um microscópio óptico comum (DM1000–Leica) e ao software QWin 3.1 (Leica) mediu a área da matriz mineralizada recém-formada nos 3 grupos experimentais. Posteriormente, foi realizada análise estatística com base na média e no desvio-padrão para obtenção do valor de p , com nível de significância de 5% ( p  < 0,05), por meio de análise de variância (ANOVA).

Resultados

Análise Histomorfológica

Aos 15 dias, o GHA apresentou neoformação de matriz osteoide associada às bordas ósseas e de modo circunjacente à algumas microesferas, que se organizavam predominantemente em monocamada e ocupavam toda a extensão do defeito ósseo, mantendo a espessura proporcional às bordas ( Fig. 2A ). Osteócitos e osteoblastos ativos estavam associados a esta matriz. Observou-se formação de tecido conjuntivo e inflamação crônica discreta com infiltrado inflamatório mononuclear e células gigantes multinucleadas, principalmente ao redor das microesferas, entre as áreas mineralizadas e as microesferas ( Fig. 2B ).

Fig. 2 Fotomicrografia do grupo com defeito preenchido com microesferas de hidroxiapatita (GHA) – 15 e 45 dias. Notar as microesferas (M) distribuídas em camada única ou dupla, com formação de matriz osteoide (*) em quase toda a extensão do defeito, com presença de osteócitos (OCs) e organizadas em lamelas ósseas concêntricas; tecido conjuntivo (CT) frouxo na área residual do defeito ósseo, com presença de células inflamatórias (Ci) mononucleares e células gigantes multinucleadas (seta amarela). Abreviaturas: Be, borda óssea; HE, hematoxilina-eosina. 15 dias ( A , B ). 45 dias ( C , D ).

No ponto biológico de 45 dias, as microesferas no GHA estavam distribuídas principalmente em multicamadas. A matriz osteoide neoformada ficou mais evidente que aos 15 dias e preencheu, em média, 4/5 do defeito ósseo no sentido centrípeto, circundado pelo biomaterial ( Fig. 2C ). As microesferas próximas às bordas estavam circundadas pela matriz osteoide recém-formada, com muitos osteoblastos ativos, osteócitos e algumas lamelas concêntricas ( Fig. 2D ). Na área residual, notou-se a formação de tecido conjuntivo de aspecto mais denso que no ponto biológico anterior, com presença de vasos sanguíneos e resposta inflamatória granulomatosa crônica discreta.

No GHAMg, aos 15 dias, com os biomateriais, notou-se neoformação da matriz osteoide no sentido centrípeto, mais evidente na região periférica do defeito ( Fig. 3A ). Assim como no GHA, os biomateriais preencheram todo o defeito ósseo, com espessura proporcional às bordas, e dispostos em monocamada. Osteoblastos ativos e numerosos osteócitos foram observados em associação à matriz osteoide. As demais áreas estavam preenchidas por tecido conjuntivo frouxo repleto de vasos sanguíneos ( Fig. 3B ) e infiltrado inflamatório granulomatoso crônico de aspecto moderado, principalmente circundando as microesferas.

Fig. 3 Fotomicrografia do grupo com defeito ósseo preenchido com microesferas de hidroxiapatita substituída por magnésio (GHAMg) – 15 dias e 45 dias. Observam-se microesferas (M) distribuídas em monocamada, permeadas por matriz osteoide recém-formada (*), em sentido centrípeto, e por tecido conjuntivo (CT), rico em vasos sanguíneos (seta preta). Abreviaturas: BE, borda óssea; V, veia central; HE, hematoxilina-eosina. 15 dias ( A , B ). 45 dias ( C , D ).

No ponto biológico de 45 dias no GHAMg, a neoformação óssea permeada pelas microesferas estendeu-se de forma centrípeta e confluente, preenchendo aproximadamente 2/3 da extensão linear do defeito ( Fig. 3C ). Além disso, notou-se que as microesferas localizadas próximas às bordas estavam circundadas por neoformação osteoide rica em osteócitos. Na área residual, houve nova formação de tecido conjuntivo, mais organizado que aos 15 dias, e grande número de capilares sanguíneos ( Fig. 3D ).

O GC, aos 15 dias, apresentou neoformação óssea com aspecto reacional associado às bordas, com osteoblastos e osteócitos ativos. Na área remanescente, notou-se deposição de tecido conjuntivo frouxo, com espessura reduzida, abundante em células fusiformes e vasos sanguíneos ( Fig. 4A ). Aos 45 dias, a nova formação óssea estendeu-se além da borda em direção centrípeta, mais evidentemente do que aos 15 dias ( Fig. 4B ). A inflamação crônica observada foi discreta e escassa. A reparação tecidual foi completada com formação de tecido conjuntivo na região e ausência de mineralização.

Fig. 4 Fotomicrografia do grupo controle (GC) – 15 e 45 dias. Note a neoformação da matriz osteoide (*) em direção centrípeta, com espessura reduzida nas bordas ósseas (BEs) e área residual preenchida por tecido conjuntivo (CT). Abreviatura: HE, hematoxilina-eosina. 15 dias ( A ) e 45 dias ( B ).

Análise Histomorfométrica

O estudo histomorfométrico não apresentou diferenças estatisticamente significativas entre os 3 grupos avaliados aos 15 dias ao analisar a área da matriz osteoide recém-formada. No ponto biológico de 45 dias, notou-se significância estatística ao comparar o GHAMg e o GHA com o GC, sendo que este último grupo apresentou maior média de matriz osteoide recém-formada ( Tabela 1 ).

Tabela 1 Porcentagem da área mineralizada neoformada em relação à área total do defeito nos pontos biológicos de 15 e 45 dias nos 3 grupos experimentais

Grupo
Tempo	GHAMg	GHA	GC	Valor de p (entre grupos)	Comparação GHAMg x GHA	Comparação de GC com GHAMg e GHA	
15 dias	25% (±29)	12% (±7)	20% (±38)	p  = 0,58 NS	p  = 0,55 NS	GHAMg: p  = 0,89 NS
GHA: p  = 0,82 NS	
45 dias	20% (±13)	25% (±11)	61% (±21)	p  = 0,01 S	p =  0,92 NS	GHAMg: p  = 0,01 S
GHA: p  = 0,02 S	
Abreviaturas: GC, grupo controle; GHA, grupo com defeito preenchido com microesferas de hidroxiapatita; GHAMg, grupo com defeito ósseo preenchido com microesferas de hidroxiapatita substituída por magnésio; NS, não estatisticamente significante; S, estatisticamente significante.

Discussão

Modelos experimentais in vivo são referência há muitas décadas em diferentes tipos de estudos e diversas áreas do conhecimento. Para avaliar biomateriais destinados à regeneração óssea, esses modelos devem apresentar características anatômicas e fisiológicas que possibilitem a compreensão dos fenômenos naturais para determinar o potencial osteogênico dos materiais investigados. Assim, dentre as diferentes possibilidades de estudos, destaca-se o defeito ósseo criado na calvária de ratos, que apresenta acesso e manipulação cirúrgica fáceis, baixo custo e boa previsibilidade e reprodutibilidade. 14 Portanto, este estudo avaliou o reparo de defeitos ósseos não críticos após implantação de microesferas de HA com substituição por Mg.

O procedimento cirúrgico para criação desse defeito promoveu dano tecidual e, consequentemente, ruptura vascular que provocou extravasamento sanguíneo e formação de coágulos, seguida de liberação de citocinas que desencadearam resposta inflamatória. Essa inflamação granulomatosa crônica, discreta e regressiva ao longo do estudo, está de acordo com o que ocorre após a implantação in vivo de um biomaterial. 15 16 Esses achados estão de acordo com aqueles observados por Santos et al., 2 Santos et al., 4 Miguel et al., 12 Daltro et al., 13 Almeida et al. 17 e Ribeiro et al. 18 Esses autores avaliaram diferentes tipos de biomateriais para regeneração óssea em calvária de ratos e descreveram a mesma resposta tecidual.

Durante os eventos fisiológicos que ocorrem na regeneração óssea, além da liberação de citocinas e mediadores químicos, há a secreção de fatores de crescimento, diferenciação celular e angiogênicos que estimulam a formação de tecido conjuntivo rico em novos vasos sanguíneos, com consequente desenvolvimento de tecido de granulação e deposição de matriz osteoide, que posteriormente se torna mineralizada. Em todos os pontos biológicos, tais características histomorfológicas foram observadas nos três grupos avaliados em nosso estudo. Aos 45 dias, no GC, a neoformação de tecido mineralizado foi de aproximadamente 60%. Porém, no GHA e no GHAMg, esse percentual foi de 25 e 20%, respectivamente. Essa diferença na neoformação óssea nos dois grupos com implantação de biomaterial em relação ao GC decorre da presença de microesferas no defeito ósseo, uma vez que estas foram sinterizadas e, consequentemente, não reabsorvidas devido à sinterização do material, um procedimento que promove alterações na rede cristalina da HA com fusão dos cristais. 19 Assim, nos grupos GHA e GHAMg, as microesferas ocuparam grande parte da área seccional do defeito e formaram uma estrutura tridimensional ao longo da extensão linear e altura do defeito ósseo.

Vale ressaltar que embora alguns autores sugiram e defendam algumas metodologias como padrão, ainda não há consenso na literatura sobre qual diâmetro exato do defeito ósseo deve ser considerado não crítico ou crítico. Um defeito ósseo “crítico” foi definido como aquele que não se regenera ao longo da vida do animal 20 ou do estudo. 21 Nestes casos, o reparo é completado por fibrose e a nova formação óssea fica restrita às bordas. 4 12 17 18 Essa situação não foi observada no presente estudo, em que o novo tecido mineralizado se formou de maneira centrípeta ao longo dos pontos biológicos, com regeneração de quase toda a área do defeito no GC aos 45 dias. Esses achados contrastam com os obtidos por autores que classificam esse defeito ósseo de 5,0 mm como crítico. 22 23 24

No que se refere à regeneração óssea, um arcabouço tridimensional (3D) é essencial para os eventos celulares e vasculares observados durante este mecanismo. Portanto, biomateriais cerâmicos têm sido amplamente estudados para esse fim em diferentes formas de apresentação e composição. Os avanços científicos e tecnológicos vivenciados nas últimas décadas têm possibilitado cada vez mais o desenvolvimento de materiais com características físico-químicas biomiméticas voltadas para a estimular a neoformação óssea. Dentre esses materiais, a HA tem sido amplamente pesquisada devido à sua biocompatibilidade, semelhança com componentes naturais da fase mineral do tecido ósseo, osteocondutividade, bioatividade 1 3 e ausência de toxicidade e imunogenicidade. Nosso estudo observou tais características nos dois grupos submetidos à implantação dos biomateriais, nos dois pontos biológicos, o que permitiu a formação de uma matriz osteoide e tecido conjuntivo entre e ao redor das microesferas.

A estrutura hexagonal da HA realiza trocas iônicas nos sítios Ca 2+ e HPO 4 3− com elementos ou grupos funcionais que fazem parte naturalmente da composição óssea para alterar a cristalinidade, solubilidade, biodegradação e, consequentemente, as propriedades biológicas do biomaterial após a implantação in vivo . 4 25 26 O Mg se destaca por desempenhar um papel fundamental no metabolismo e crescimento ósseo: a deficiência desse elemento inibe a atividade dos osteoblastos, enquanto favorece a sobrevida e a atuação dos osteoclastos. 27 28 Além disso, a presença de Mg contribui para a biomineralização, principalmente na fase inicial da osteogênese: aumenta a cinética de nucleação da HA, retarda sua cristalização e pode interferir nas alterações qualitativas da matriz óssea. 29 Isso provavelmente explica por que a média de formação óssea aos 15 dias foi maior no GHAMg do que no GHA, mas sem diferenças estatisticamente significativas. Apesar disso, esse padrão não se repetiu após 45 dias e a formação média de matriz osteoide foi semelhante entre esses grupos.

O Mg também tem efeito essencial na promoção da angiogênese, na estimulação das células endoteliais e na produção de fatores de crescimento vascular, 30 o que pode justificar a presença de vasos sanguíneos mais evidentes no GHAMg do que nos demais grupos ao longo do estudo. Além disso, a incorporação deste metal na estrutura da HA promoveu uma ligeira diminuição na cristalinidade do biomaterial sem prejudicar a biodegradação da cerâmica, provavelmente devido à sinterização.

A biocompatibilidade e bioatividade dos biomateriais aqui estudados demonstram que esses materiais podem ser utilizados em futuras aplicações clínicas, em especial como biomaterial de preenchimento. Diante dos resultados obtidos neste trabalho, novos estudos deverão analisar estes biomateriais sem tratamento térmico (sinterização) e com outras variações na concentração de Mg em defeitos críticos (8,0 mm) e não críticos (5,0 mm) para melhor caracterizar o potencial osteogênico destas cerâmicas com substituição por este metal.

Conclusões

Os biomateriais avaliados neste estudo são biocompatíveis, osteocondutores e bioativos. O Mg substituído na HA estimulou a maior formação óssea apenas na fase inicial do reparo ósseo (15 dias), com formação de matriz osteoide de forma semelhante entre as cerâmicas na fase final do estudo.

Conflito de Interesses Os autores não têm conflito de interesses a declarar.

Cada autor contribuiu individual e significativamente para o desenvolvimento deste artigo: JAS: Concepção e delineamento experimental; preparação do manuscrito; e procedimentos cirúrgicos. GGS: Preparação do manuscrito e procedimentos cirúrgicos e técnicos. IIAR: Preparação do manuscrito e procedimentos cirúrgicos e técnicos. AMGBS: Preparação do manuscrito e revisão do texto em inglês. ICB: Procedimentos cirúrgicos e técnicos e análise histopatológica. MAM: Concepção e delineamento experimental e análise histopatológica. MAB: Concepção e delineamento experimental e análise histopatológica. FBM: Concepção e delineamento experimental; procedimentos cirúrgicos e técnicos e revisão crítica.

The authors contributed individually and significantly to the development of this article: JAS: Study conception and design; manuscript preparation; and surgical procedures. GGS: Manuscript preparation; and surgical and technical procedures. IIAR: Manuscript preparation; and surgical and technical procedures. AMGBS: Manuscript preparation and english text review. ICB: Surgical and technical procedures and histopathological analysis. MAM: Study conception and design; and histopathological analysis. MAB: Study conception and design; and histopathological analysis. FBM: Study conception and design; surgical and technical procedures; and critical review.

Trabalho desenvolvido no Departamento de Ortopedia e Traumatologia, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil.

Work carried out at the Department of Orthopedics and Traumatology, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de Sao Paulo, Sao Paulo, SP, Brazil.
==== Refs
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