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Rev Bras Ortop (Sao Paulo)
Rev Bras Ortop (Sao Paulo)
10.1055/s-00042410
Revista Brasileira de Ortopedia
0102-3616
1982-4378
Thieme Revinter Publicações Ltda. Rua do Matoso 170, Rio de Janeiro, RJ, CEP 20270-135, Brazil

10.1055/s-0044-1788786
RBO-D-23-00273
Artigo Original
Coluna
Comparison of Bone Graft Preparations to Treat a Critical Bone Defect on a Rodent Animal Model
http://orcid.org/0000-0003-2374-8989
Vieira Rian Souza 1
Borges Renan Ernesto Reis 2
Tiezzi Daniel Guimarães 3
Shimano Antonio Carlos 1
Zamarioli Ariane 1
Defino Helton Luiz Aparecido 1
1 Departamento de Ortopedia e Anestesiologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil
2 Serviço de Cirurgia da Mão, Pontifícia Universidade Católica de Campinas, Campinas, SP, Brasil
3 Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Divisão de Mastologia e Laboratório de Ciências de Dados Translacionais, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil
Endereço para correspondência Rian Souza Vieira, MD, MSc Departamento de Ortopedia e Anestesiologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão PretoAvenida Bandeirantes, 900, Ribeirão Preto, SPBrasil, 14049-900rianvieira@alumni.usp.br
04 9 2024
8 2024
1 9 2024
59 4 e532e541
09 10 2023
18 3 2024
The Author(s). This is an open access article published by Thieme under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License, permitting copying and reproduction so long as the original work is given appropriate credit ( https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ )
2024
The Author(s).
https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Objective  Although autologous bone grafting is the most widely used treatment for bone defects, the most effective preparation remains unclear. This animal study aimed to compare different autologous bone grafting preparation for the treatment of rat́s calvaria critical bone defect.

Methods  122 rats were randomly allocated into three groups: Simulado, Macerated and Chopped. The specimens underwent craniotomies at the top center of their calvarias with a 7mm diameter circumferential cutter drill. The critical bone defect produced was treated or not according to the group the specimen wasallocated. The rats were euthanized at 3, 6 or 12 weeks post-op and its calvarias were analyzed by histomorphometry, bone densitometry, nanocomputed tomography (nCT), and biomechanical tests.

Results  The histomorphometry analysis showed the highest percentage of fulfillment of the critical bone defect in the chopped and macerated group when compared to simulado. The densitometry assessment evidenced higher bone mass at all endpoints analysis (p < 0.05) in the chopped group. The nCT data exhibited an expressive increase of bone in the chopped group when compared with the simulado and macerated groups. The biomechanical tests exhibited highest values of deformation, maximum force, and relative stiffness in the chopped group at any time of euthanasia (p < 0.05).

Conclusions  Our experimental work showed that chopped bone grafting preparation exhibited significant better outcomes than macerated in the treatment of a critical bone defect in rat́s calvaria.

Keywords

bone and bones
bone regeneration
bone transplantation
models, animal
Suporte Financeiro Os autores declaram que este estudo não recebeu nenhum financiamento específico de agências de fomento dos setores público, comercial ou sem fins lucrativos. Financial Support The authors declare that this research did not receive any specific grant from funding agencies in the public, commercial, or not-forprofit sectors.
==== Body
pmcIntroduction

The incidence of bone defects is increasing and demanding solutions. 1 2 3 These injuries have profound economic and clinical impacts, treatment outcomes are limited by high rates of complications. 4 5 6 Autologous bone grafting is the most widely used treatment for bone defects as it is easy to obtain, combines properties and does not induce immune responses nor transmit infections. 7 8 9 However, the most effective autologous bone graft technique is uncertain. 10 11

A critical size bone defect is an orthotopic defect that will not heal without intervention 12 13 or the smallest size of tissue defect that will not completely heal over a lifetime. 12 14 In the rat calvaria model, defects larger than five millimeters are considered critical. 15 16 17

The keystone to the preclinical development of translational technologies is the reliable reproducibility, analogues to the clinical condition they are investigating in animal models. 12 18 We developed an animal based on a rat calvaria critical bone defect treated with different bone graft techniques. Bone regeneration was evaluated in different endpoint periods by histomorphometry, nCT, bone densitometry and biomechanical tests.

This study compared distinct autologous local bone graft treatment techniques used to treat a rat calvaria critical bone defect.

Materials and Methods

The work was approved by our institution's animal ethics committee under protocol number CEUA: 120/2019

Seven-week-old male Wistar rats weighing 200 g (± 10 g) were obtained from the central animal facility of our institution and housed in individual cages with environmental enrichment in a room with controlled conditions of humidity (55-60%), temperature (23 ± 1°C), and an artificial light/dark cycle of 12 hours. The experimental procedures started after the specimens reached maturity with 300 g (± 10g) and ten-weeks of age.

One hundred and eight (108) rats were randomly divided into three groups ( n  = 36 per group): (1) Sham: rats with calvaria critical bone defect (7mm in diameter); (2) Macerated: rats with calvaria critical bone defect treated with macerated local autologous bone graft; (3) Chopped: rats with calvaria critical bone defect treated with chopped local autologous bone graft. The experimental procedures (initial surgeries and euthanasia surgeries) were carried out at the same time, surgeon and conditions to minimize biases.

All surgical instruments were sterilized and cooled down to room temperature (23°C). The operating table and instruments were sterilized with ethanol at a 70% concentration.

All rats were anesthetized by intramuscular (IM) injection of Cetamin® by Syntec (Ketamine hydrochloride 10%, 60 mg/kg) and Xylazin® by Syntec (Xylazine hydrochloride 2%, 7.5 mg/kg) and shaved from the bridge of the snout to the distal end of the calvaria. A swab was used to remove hair trimmings and Lacrilube® by Allergan

Inc. applied to each eye. The calvaria was painted with iodine. A sterile surgical field was placed over with a round opening above the calvaria.

A 1.5cm longitudinal incision from superficial skin down to the periosteum over the calvaria, from the nasal bone to caudal to the middle sagittal crest or bregma. The periosteum was divided in half with the scalpel through a sagittal midline elevating it from the skull. A self-retaining retractor spreads the soft tissues and exposes the underlying bone.

A targeted area centered at the intersection of the two calvaria midlines anteroposterior, side to side was drawn. The drill Strong® Micro Motor 210/105L and Zipperer® trephine (7mm total diameter) attached scores the top of the calvaria at 1500 rpm, with sterile saline drops (1 every 2 seconds) to prevent thermal injury. The drill was handled with gentle pressure against the skull surface to produce the defect. An elevator was used into the osteotomy margin completing the defect. The same elevator was used to lift the cylinder of the bone, releasing the dura from the underside of it and pulling the bone out ( Fig. 1 ).

Fig. 1 Technical steps of the initial surgery.

The defect was washed with saline to remove debris before grafting ( Figs. 2 and 3 ). The periosteum was closed using a running suture and subsequently the skin using simple gut suture. The rats were placed under observation for any sign of purposeful movement and then transferred to normal husbandry cages.

Fig. 2 Macerated bone graft preparation filling the critical defect.

Fig. 3 Chopped bone graft preparation filling the critical defect.

The daily postoperative care was composed of a health assessment including wound examination, prevention of distress, neurological observation and optimized analgesia. All specimens were treated with tramadol (25 mg/kg) subcutaneously twice daily for 3 days for postoperative pain. The cages were cleaned, and water / food changed three times a week. Rats had their body masses registered routinely once a week. The groups were followed postoperatively and each of them were separated into three subgroups according to the endpoint analysis: 3, 6 and 12 weeks post-surgery.

The rats in all the three groups were sacrificed in three different moments: 3, 6 and 12 weeks post operatively. The euthanasia method used was intramuscular injection of anesthetic overdose of Cetamin® and Xylazin®.

Similar initial procedure steps were taken with a slightly longer (2.5cm) surgical access centered in the previous incision. A rectangular segment of the rat calvaria was delimited and cut with a serrated disc SDT® fine granulometry 19/0.15mm at 9000 rpm attached to the same Strong® Micro Motor 210/105L. The calvaria fragments were collected containing the critical bone defect surrounded by original skull bone sized average 15.01 × 11.85 mm ( Fig. 4 ).

Fig. 4 Calvarial rectangle obtained after euthanasia.

A total of 58 samples were designated to histology and were fixed in cold 4% paraformaldehyde while the other 57 samples were embedded in alcohol 70% recipients for bone densitometry assessment, ntomography and mechanical tests.

The routine of decalcification with cold 10% EDTA, progressive dehydration with crescent alcohol concentrations, clearing in xylene with its 3 exchanges and framing in paraffin were performed at the Histology Lab of our Institution. When embedded in paraffin, 5mm sections were obtained and placed on charged histology laminas (Manco Inc., USA). Staining was performed with hematoxylin and eosin (HE) on coronal sections. A bright field microscopy (Axiovert; Carl Zeiss®, Germany) was used to explore those laminas. A CCD camera (AxioCam MRc; Carl Zeiss®, Germany) captured images with many different magnifications for posterior analysis ( Fig. 5 ). A total of 500 histology laminas were produced with these 58 samples.

Fig. 5 Photomicrographs: 1A sham, 1B Macerated e 1C Chopped (12 weeks post-op).

Bone densitometry analysis was performed at the calvaria samples containing the critical bone defect (total of 57 samples) by Dual-energy X-ray absorptiometry (DXA) using a Lunar® DPX-IQ densitometer (Lunar®; software version 4.7e, GE Healthcare®, United Kingdom). A ROI (region of interest) of approximately 49 mm 2 was used to assess the new bone formation. Bone mineral density (BMD, g/cm 2 ) and bone mineral content (BMC, g) were measured as protocol.

The DXA samples were then organized and scanned by the Nano tomograph Phoenix v|tome|x s – General Electric® ( Fig. 6 ). Images of each specimen were reconstructed with specific software ( Dataviewer 1.5.1.2 64bit - SkyScan® Bruker® ) and analyzed by CTAn ( CTAn v.1.15.4.0 64bit - SkyScan® Bruker® ) to determine morphometric parameters in selected regions of interest (ROI). All morphometric parameters are in accordance with the ASBMR nomenclature: Bone Volume (BV), Percent Bone Volume (BV/TV), Bone surface / Volume ratio (BS/BV), Structure model index (SMI), Trabecular Thickness (Tb.Th), Trabecular number (Tb.N), Trabecular separation (Tb.Sp), Total porosity percent (Po tot) and Connectivity density (Conn.Dn).

Fig. 6 Nanotomographic appearance of the sham, chopped and macerated groups.

The 57 calvaria samples were mechanically stressed in a perforation pushout test. A universal testing machine was used for critical bone defect stress tests with a 50N load cell (Trd 28–EMIC DL 10000®) . The settings of the tests were: 1mm/min progression speed, 1N pre-load and 30s accommodation time. The bone sample was positioned on a custom-made metallic support with an 8mm diameter circumferential hole centered and aligned with the critical bone defect center. A cylindrical metal pusher with 7mm diameter also centered and aligned with the bone defect and the support circumferential hole center gradually descended to contact the samples, preload and then gradually stress the with or without graft until complete disruption ( Fig. 7 ). Using the Tesc 3.04 software script, raw data were filtered and measured maximum force, deformation, relative stiffness and elasticity maximum strength. The samples were hydrated with saline during the tests.

Fig. 7 Mechanical testing from different angles and in detail.

Hypothesis tests were performed to analyze the variation on bone regeneration across different bone engraftment techniques compared to the sham group. All variables were tested for normality based on visual histogram and the Shapiro-Wilks test. Descriptive statistics used the median and median absolute deviation (MAD) as measures of central tendency and dispersion, respectively. We applied the nonparametric KruskalWallis test followed by the post hoc Dunn for Kruskal-Wallis multiple comparison. The Spearman rank correlation index was calculated to analyze the relationship between multiple parameters obtained by nCT, bone densitometry and the stress test. All statistical analyses were performed in R for Linux/GNU version 4.1.0 and the p value < 0.05 was considered statistically significant.

Results

A qualitative histological analysis evidenced a higher proportion of new bone formation in the critical bone defect of the grafted groups when compared to the shams. Furthermore, the chopped group is suggested to induce the uppermost new bone formation of all under bright field microscopy qualitative analysis.

In accordance, our quantitative analysis proved a higher percentage of new bone formed in the Chopped and Macerated groups when compared to Sham (p = 0.008). Although the Chopped group showed the highest percentages of new bone formation, the difference with the Macerate group was not statistically relevant (p = 0.1) ( Fig. 4 ). We understand this observed trend deserves attention.

We observed a significant overall increase in BMD by comparing the different endpoint periods (p < 0.001) ( Table 1 ). At 3 weeks after the procedure, the median BMD was 0.01 in the sham group (MAD = 0.001), 0.026 (MAD = 0.001) in the macerated group, and 0.041 (MAD = 0.0007) in the chopped group (p = 0.0004). The differences persisted at 6 and 12 weeks (p = 0.0004 and p = 0.0002, respectively). In the sham group the median BMD was 0.0085 (MAD = 0.0007) and 0.03 (MAD = 0.001) at 6 and 12 weeks, respectively. In the macerated group the median BMD was 0.0185 (MAD = 0.0007) and 0.04 (MAD = 0.001), and in the chopped group the median BMD was 0.031 (MAD = 0.002) and 0.054 (MAD = 0.001) at 6 and 12 weeks, respectively ( Fig. 8 ). The post hoc test for pairwise comparison has demonstrated the increment in bone regeneration comparing the chopped group with the sham.

Fig. 8 Bone mineral concentration (BMC) and bone mineral density (DMO) in groups and times.

Table 1 Densitometry statistics summary

Variable	Weeks	Groups	Median	MAD	P Value	
BMC	3w				0.00038150651248	
		Sham	0.002	0		
		Chopped	0.009	0.0007413		
		Macerated	0.005	0		
BMC	6w				0.00067991117923	
		Sham	0.0015	0.0007413		
		Chopped	0.0055	0.0007413		
		Macerated	0.003	0		
BMC	12w				0.00019298618864	
		Sham	0.003	0		
		Chopped	0.015	0.0014826		
		Macerated	0.008	0.0014826		
BMD	3w				0.00048367583690	
		Sham	0.0105	0.0014826		
		Chopped	0.0415	0.0007413		
		Macerated	0.026	0.0014826		
BMD	6w				0.00046850172588	
		Sham	0.0085	0.0007413		
		Chopped	0.0315	0.0022239		
		Macerated	0.0185	0.0007413		
BMD	12w				0.00020323763567	
		Sham	0.03	0.0014826		
		Chopped	0.054	0.0014826		
		Macerated	0.04	0.0014826		
BMC, Bone mass content; BMD, Bone mineral content.

We analyzed the nCT parameters across the experimental groups. The BV and BV/TV estimate the volume of bone regenerated in the critical bone defect area. We observed a significant overall bone regeneration in chopped and macerated groups compared to the sham group (p < 0.0001) ( Fig. 9 ). The median BV in the sham group at 3, 6 and 12 weeks were 1.4 (MAD= 0.2), 3.1 (MAD= 0.35) and 3.3 (MAD= 0.6), respectively. In the macerated group the median BV at 3, 6 and 12 weeks were 1.3 (MAD= 0.6), 5.4 (MAD= 2.1) and 4.7 (MAD= 2.3) ( Table 2 ).

Table 2 Nano tomography statistics summary

Variable	Weeks	Group	Median	P Value	
BV	3w			0,002338	
		Sham	3,166115		
		Chopped	9,8977		
		Macerated	5,39414		
BV	6w			0,0033992	
		Sham	1,39563		
		Chopped	6,83119		
		Macerated	1,30313		
BV	12w			0,0013393	
		Sham	3,29243		
		Chopped	12,90203		
		Macerated	4,74866		
BV/TV	3w			0,0030956	
		Sham	1,60475		
		Chopped	8,1638		
		Macerated	2,360649		
BV/TV	6w			0,0029369	
		Sham	0,622355		
		Chopped	6,21231		
		Macerated	0,812585		
BV/TV	12w			0,0003588	
		Sham	1,22118		
		Chopped	11,49151		
		Macerated	4,80795		
BV, Bone Volume; TV, Toal Volume.

Fig. 9 Bone Volume (BV) and Bone Volume by Total Volume (BV/TV).

We analyzed the correlation between the BMD and microstructural parameters obtained by nCT and detected a high positive correlation with BV, BV/TV and Tb.N (rho= 0.77, rho= 0.82 and rh0= 0.81, respectively), and a strong anticorrelation with trabecular separation and total porosity (rho= -0.73 and rho= -0.82, respectively).

The biomechanical analysis was performed to infer the behavior of the new bone formation under a stress test. We measured the maximum force, the deformation, the relative stiffness and the elasticity maximum strength for every calvaria specimen. We observed that the calvaria specimens from rats subjected to the engraftment with chopped bone were significantly more resistant to the stress ( Table 3 ) (p < 0.0001 for all variables). The overall median (MAD) maximum force, the deformation, the relative stiffness and the elasticity maximum strength in the chopped group was 36 (19.9), 2.6 (0.8), 12.5 (5.5) and 39.1 (20.5), respectively, compared to 10.1 (4), 1.39 (0.3), 6.8 (3) and 6.8 (2.8) in sham and 13.1 (9.2), 1.9 (1), 4.7 (3) and 14.6 (11) in macerated groups ( Fig. 10 ).

Fig. 10 Maximum force (N) and deformation (mm).

Table 3 Biomechanical test statistics summary

Variable	Weeks	Grupo	Median	P Value	
Maximum strenght	3w			0,002338	
		Sham	8,375		
		Chopped	34,54		
		Macerated	13,06		
Maximum strenght	6w			0,006104	
		Sham	11		
		Chopped	36,77		
		Macerated	10,92		
Maximum strenght	12w			0,003498	
		Sham	10,56		
		Chopped	35,99		
		Macerated	14,075		
Deformation	3w			0,041776	
		Sham	1,44		
		Chopped	2,415		
		Macerated	2,965		
Deformation	6w			0,010158	
		Sham	1,32		
		Chopped	2,565		
		Macerated	1,39		
Deformation	12w			0,014718	
		Sham	1,13		
		Chopped	2,64		
		Macerated	2,185		

Discussion

Bone defects represent relevant challenges to Orthopedists. 1 2 3 4 19 20 The treatments for critical bone defects often result in complications. 4 5 6 There is also an association with prolonged recovery decreasing quality of life. 21

The success of bone grafting is limited by many factors such as remodeling capacities of the host, material itself, surgical technique 22 and even how the graft is handled. 23 24 Autografting is the most widely used treatment for bone defects, but it remains unclear what preparation technique will induce the greater regeneration. 8 24 25 It is well stablished that graft dimensions influence the outcome of treatment 26 27 28 and the calvaria has already been described as a donor site 29 but, to the best of our knowledge, there was not a study comparing macerated and chopped local autologous bone graft preparations.

From macroscopic and clinical to microstructural level, our data demonstrated the higher efficiency of chopped bone graft preparation at inducing bone regeneration.

Macroscopically, we detected higher bone mass (density and content) in the Chopped group when compared to the Sham and Macerated at all endpoints: three, six and twelve-weeks following surgery. Likewise, our mechanical tests also confirmed the higher effectiveness of chopped bone graft at inducing bone regeneration with stronger properties. As of note, the chopped group exhibited newly formed bone with higher maximum force, stiffness, and deformation, which demands heavier loads prior to failure and has a higher modulus of elasticity. Histologically, our qualitative analysis suggests a much higher percentage of woven bone formation and critical bone defect fulfillment in the Chopped samples than in the Macerated group, which could be confirmed microscopically by our nCT assessment. The Chopped group exhibited a remarkable osteogenic effect at increasing the bone formation-related parameters of bone volume and fraction, connectivity density, trabecular thickness and number, concomitant with decreases in resorption-related parameter; bone surface/volume ratio, structure model index, trabecular separation and porosity.

It is important to highlight that models of rat calvaria critical bone defect can be used for the study of bone regeneration and biomaterials before considering larger animals or future potential human applications. 30 The first rat calvaria model of a bone defect was described in 1973 by Freeman and Turnbull but only accomplished by Takagi and Urist in 1982. We confirmed the efficacy of our model as no spontaneous bone regeneration occurred in the Sham group at any endpoint.

Among the limitations of our study, we may include a lack in elucidating the mechanisms leading to a better bone regeneration due to chopped bone graft preparation. Although it was not the purpose of our study, future studies should include molecular assessment to expand our critical capacity and data scientific production, as well as to target potent pharmacological therapies to further induce regeneration. The comparison among local autologous bone graft, distant autologous bone graft, bone substitutes adjuvants should be further investigated in the bone healing processes to reach the best available critical bone defect treatment.

Conclusion

This study evidenced that different techniques to prepare and locally treat bone defects may play an important role at inducing bone regeneration. We used an animal model of bone defect that did not spontaneously heal throughout the experiment. Conversely, our protocols for local autologous bone graft induced bone regeneration in this animal model. The chopped bone graft exhibited newly formed bone with higher mass, improved microarchitecture and better mechanical integrity than the newly formed bone followed by macerated bone graft.

Comparação de preparações de enxertos ósseos para tratamento de defeitos ósseos críticos em um modelo animal roedor
Resumo

Objetivo Embora enxertos ósseos autólogos sejam o tratamento mais utilizado para defeitos ósseos, a preparação mais eficaz ainda é obscura. Este estudo animal teve como objetivo comparar diferentes preparações de enxerto ósseo autólogo para o tratamento de defeito ósseo crítico no crânio de ratos.

Métodos  No total, 122 ratos foram alocados aleatoriamente em três grupos: Simulado, enxerto macerado e enxerto picado. Os espécimes foram submetidos a craniotomias no centro superior do crânio com broca de corte circunferencial de 7 mm de diâmetro. O defeito ósseo crítico produzido foi tratado ou não de acordo com o grupo de alocação do animal. Os ratos foram eutanasiados às 3, 6 ou 12 semanas após a cirurgia e seus crânios foram analisados por histomorfometria, densitometria óssea, nanotomografia computadorizada (nTC) e testes biomecânicos.

Resultados  A análise histomorfométrica mostrou maior percentual de preenchimento do defeito ósseo crítico no grupo picado e macerado em comparação ao simulado. A avaliação densitométrica evidenciou maior massa óssea em todos os desfechos de análise (p < 0,05) no grupo picado. Os dados de nTC revelaram um aumento ósseo expressivo no grupo picado em comparação aos grupos simulado e macerado. Os testes biomecânicos mostraram maiores valores de deformação, resistência máxima e rigidez relativa no grupo picado em qualquer momento da eutanásia (p < 0,05).

Conclusões  Nosso estudo mostrou que a preparação de enxerto ósseo picado gerou resultados significativamente melhores do que os enxertos macerados no tratamento de defeitos ósseos críticos no crânio de ratos.

Palavras-chave

modelos animais
osso e ossos
regeneração óssea
transplante ósseo
Introdução

A incidência de defeitos ósseos tem aumentado e exige soluções. 1 2 3 Essas lesões têm profundos impactos econômicos e clínicos; além disso, os desfechos do tratamento são limitados pelas altas taxas de complicações. 4 5 6 O enxerto ósseo autólogo é o tratamento mais utilizado para defeitos ósseos por ser fácil de obter, combinar propriedades e não induzir respostas imunes ou transmitir infecções. 7 8 9 No entanto, não se sabe a técnica de enxerto ósseo autólogo mais eficaz. 10 11

Um defeito ósseo de tamanho crítico é um defeito ortotópico que não cicatriza sem intervenção 12 13 ou o defeito tecidual de menor tamanho que não cicatriza por completo ao longo da vida. 12 14 No modelo de crânio de rato, defeitos maiores que 5 mm são considerados críticos. 15 16 17

A pedra angular do desenvolvimento pré-clínico de tecnologias translacionais é a reprodutibilidade confiável, análoga à condição clínica investigada em modelos animais. 12 18 Desenvolvemos um modelo animal de defeito ósseo crítico em crânios de ratos e seu tratamento com diferentes técnicas de enxerto ósseo. A regeneração óssea foi avaliada em diferentes tempos por histomorfometria, nanotomografia computadorizada (nTC), densitometria óssea e testes biomecânicos.

Este estudo comparou diferentes técnicas de tratamento de defeitos ósseos críticos no crânio de ratos com enxertos ósseos autólogos locais.

Materiais e Métodos

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética animal de nossa instituição sob número de protocolo CEUA 120/2019.

Ratos Wistar machos com 7 semanas de idade, pesando 200 g (± 10 g) foram obtidos do biotério central de nossa instituição e alojados em gaiolas individuais com enriquecimento ambiental em sala com condições controladas de umidade (55 a 60%), temperatura (23 ± 1 C) e ciclo claro/escuro artificial de 12 horas. Os procedimentos experimentais começaram depois que os espécimes atingiram a maturidade, com 300 g (±10 g) e 10 semanas de idade.

Cento e oito (108) ratos foram divididos aleatoriamente em três grupos (36 animais por grupo): (1) grupo simulado: ratos com defeito ósseo crítico no crânio (7 mm de diâmetro); (2) grupo macerado: ratos com defeito ósseo crítico no crânio tratados com enxerto ósseo autólogo local macerado; (3) grupo picado: ratos com defeito ósseo crítico no crânio tratados com enxerto ósseo autólogo local picado. Os procedimentos experimentais (primeiras cirurgias e cirurgias de eutanásia) foram realizados ao mesmo tempo, pelo mesmo cirurgião e nas mesmas condições para minimizar vieses.

Todos os instrumentos cirúrgicos foram esterilizados e resfriados à temperatura ambiente (23 C). A mesa cirúrgica e os instrumentos foram esterilizados com etanol a 70%.

Todos os ratos foram anestesiados por injeção intramuscular (IM) de Cetamin® da Syntec (cloridrato de cetamina 10%, 60 mg/kg) e Xylazin® da Syntec (cloridrato de xilazina 2%, 7,5 mg/kg) e tricotomizados da ponte nasal até a extremidade distal do crânio. Um cotonete foi utilizado para retirada de aparas de pelos e Lacrilube® da Allergan Inc. foi aplicado em cada olho. O crânio foi pintado com iodo. Um campo cirúrgico estéril foi colocado com uma abertura redonda acima do crânio.

Uma incisão longitudinal de 1,5 cm da pele superficial foi estendida até o periósteo sobre o crânio, do osso nasal até caudal à crista sagital média ou bregma. O periósteo foi dividido ao meio com o bisturi por meio de uma linha média sagital, elevando-o do crânio. Um afastador automático retraiu os tecidos moles e expos o osso subjacente.

Uma área alvo centralizada na intersecção das duas linhas médias do crânio anteroposterior, de lado a lado, foi desenhada. Uma broca Strong® Micro Motor 210/105L e uma trefina Zipperer® (7 mm de diâmetro total) fixadas marcaram o topo do crânio a 1.500 rpm, com aplicação de salina estéril em gotas (uma gota a cada 2 segundos) para evitar lesão térmica. A broca foi manuseada com leve pressão contra a superfície do crânio para produzir o defeito. Um elevador foi utilizado na margem da osteotomia completando o defeito. O mesmo elevador foi usado para levantar o cilindro do osso, liberando a dura-máter da parte inferior e puxando o osso para fora ( Fig. 1 ).

Fig. 1 Etapas técnicas da primeira cirurgia.

O defeito foi lavado com solução salina para remoção de detritos antes do enxerto ( Figs. 2 e 3 ). O periósteo foi fechado com sutura contínua e a pele recebeu sutura simples com categute. Os ratos foram colocados sob observação quanto a quaisquer sinais de movimento proposital e depois transferidos para as gaiolas normais de criação.

Fig. 2 Preparação de enxerto ósseo macerado para preenchimento do defeito crítico.

Fig. 3 Preparação de enxerto ósseo picado para preenchimento do defeito crítico.

Os cuidados pós-operatórios diários foram compostos por avaliação de saúde, incluindo exame de feridas, prevenção de sofrimento, observação neurológica e analgesia otimizada. Todos os animais foram tratados com tramadol (25 mg/kg) por via subcutânea duas vezes ao dia durante 3 dias para evitar dor pós-operatória. As gaiolas foram limpas e a água/comida trocada três vezes por semana. Os ratos tiveram suas massas corporais registradas uma vez por semana. Os grupos foram acompanhados no pós-operatório e cada um deles foi separado em três subgrupos de acordo com a análise do desfecho, às 3, 6 e 12 semanas após a cirurgia.

Os ratos dos três grupos foram eutanasiados em três momentos diferentes, às 3, 6 e 12 semanas após as cirurgias. O método de eutanásia utilizado foi a injeção intramuscular de overdose anestésica de Cetamin® e Xylazin®.

Procedimentos iniciais semelhantes foram realizados com acesso cirúrgico um pouco maior (2,5 cm) centrado na incisão anterior. Um segmento retangular do crânio do rato foi delimitado e seccionado com disco serrilhado SDT® de granulometria fina 19/0,15 mm a 9.000 rpm acoplado ao mesmo Strong® Micro Motor 210/105L. Os fragmentos de crânio contendo o defeito ósseo crítico circundado por osso craniano original, com tamanho médio de 15,01 × 11,85 mm, foram coletados ( Fig. 4 ).

Fig. 4 Retângulo do crânio obtido após a eutanásia.

Um total de 58 amostras foram destinadas à histologia e fixadas com paraformaldeído a 4% frio, enquanto as outras 57 amostras foram fixadas com álcool a 70% para avaliação de densitometria óssea, nTC e testes mecânicos.

A rotina de descalcificação com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) a 10% frio, desidratação progressiva com concentrações crescentes de álcool, clarificação em xilol em três trocas e emblocamento em parafina foi realizada no Laboratório de Histologia de nossa Instituição. Após a inclusão em parafina, cortes de 5 mm foram obtidos e colocados em lâminas histológicas carregadas (Manco Inc., EUA). A coloração dos cortes coronais utilizou hematoxilina e eosina (HE). Um microscópio de campo claro (Axiovert; Carl Zeiss®, Alemanha) foi utilizado para análise das lâminas. Uma câmera CCD (AxioCam MRc; Carl Zeiss®, Alemanha) capturou imagens com diversas ampliações para interpretação posterior ( Fig. 5 ). No total, 500 lâminas histológicas foram produzidas com essas 58 amostras.

Fig. 5 Fotomicrografias: 1A, grupo simulado; 1B, grupo macerado; 1C, grupo picado (12 semanas após a cirurgia).

A análise de densitometria óssea foi realizada nas 57 amostras de crânio contendo o defeito ósseo crítico por absorciometria de raios X de dupla energia (DXA) usando um densitômetro Lunar® DPX-IQ (Lunar®; software versão 4.7e, GE Healthcare®, Reino Unido). Uma região de interesse (ROI) de aproximadamente 49 mm 2 foi utilizada para avaliação da nova formação óssea. A densidade mineral óssea (BMD, g/cm 2 ) e o conteúdo mineral ósseo (BMC, g) foram medidos conforme protocolo.

As amostras de DXA foram então organizadas e escaneadas com Nano tomograph Phoenix v|tome|x s – General Electric ® ( Fig. 6 ). As imagens de cada espécime foram reconstruídas com software específico (Dataviewer 1.5.1.2 64 bits - SkyScan® Bruker®) e analisadas por CTAn (CTAn v.1.15.4.0 64 bits - SkyScan® Bruker®) para determinar parâmetros morfométricos nas ROIs selecionadas. Todos os parâmetros morfométricos estão de acordo com a nomenclatura da American Society for Bone and Mineral Research (ASBMR): volume ósseo (BV), volume ósseo percentual (BV/TV), relação superfície/volume ósseo (BS/BV), índice de modelo de estrutura (SMI), espessura trabecular (Tb.Th), número trabecular (Tb.N), separação trabecular (Tb.Sp), porcentagem de porosidade total (Po tot) e densidade de conectividade (Conn.Dn).

Fig. 6 Aparência nanotomográfica dos grupos simulado, picado e macerado.

As 57 amostras de crânio foram tensionadas mecanicamente em um teste de perfuração do tipo push-out . Os testes de estresse de defeitos ósseos críticos ocorreram em equipamento universal com célula de carga de 50 N (Trd 28–EMIC DL 10000®). As configurações dos testes foram velocidade de progressão de 1 mm/min, pré-carga de 1 N e tempo de acomodação de 30 s. A amostra óssea foi posicionada sobre um suporte metálico customizado com furo circunferencial de 8 mm de diâmetro centralizado e alinhado com o centro do defeito ósseo crítico. Um empurrador metálico cilíndrico com 7 mm de diâmetro também centrado e alinhado com o defeito ósseo e o centro do furo circunferencial de suporte desceu gradativamente até entrar em contato com as amostras, pré-carregar e então tensionar gradativamente as amostras com ou sem enxerto até o rompimento completo ( Fig. 7 ). Utilizando o script do software Tesc 3.04, os dados brutos foram filtrados e medidas de força máxima, deformação, rigidez relativa e resistência máxima de elasticidade. As amostras foram hidratadas com solução salina durante os testes.

Fig. 7 Testes mecânicos de diferentes ângulos e em detalhes.

Os testes de hipóteses analisaram a variação na regeneração óssea com as diferentes técnicas de enxerto ósseo em comparação com o grupo simulado. Todas as variáveis foram testadas quanto à normalidade com base no histograma visual e no teste de Shapiro-Wilks. A estatística descritiva utilizou a mediana e o desvio absoluto da mediana (MAD) como medidas de tendência central e dispersão, respectivamente. Aplicou-se o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido do teste post-hoc de Dunn para comparação múltipla de Kruskal-Wallis. O índice de correlação de Spearman foi calculado para analisar a relação entre os múltiplos parâmetros obtidos por nTC, densitometria óssea e testes de estresse. Todas as análises estatísticas foram realizadas em R para Linux/GNU versão 4.1.0 e o valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Uma análise histológica qualitativa evidenciou maior proporção de neoformação óssea no defeito ósseo crítico dos grupos enxertados em comparação ao grupo simulado. Além disso, a análise qualitativa de microscopia de campo claro sugeriu que o grupo picado induzia a maior formação óssea de todas.

Da mesma forma, a análise quantitativa comprovou o maior percentual de osso novo formado nos grupos picado e macerado em comparação ao grupo simulado (p = 0,008). Embora o grupo picado tenha apresentado os maiores percentuais de neoformação óssea, a diferença com o grupo macerado não foi estatisticamente relevante (p = 0,1) ( Fig. 4 ). Acreditamos que essa tendência mereça atenção.

Observamos um aumento geral significativo na BMD ao comparar os diferentes períodos de desfecho (p < 0,001) ( Tabela 1 ). Três semanas após o procedimento, a mediana da BMD foi de 0,01 (MAD = 0,001) no grupo simulado, 0,026 (MAD = 0,001) no grupo macerado e 0,041 (MAD = 0,0007) no grupo picado (p = 0,0004). As diferenças persistiram às 6 e 12 semanas (p = 0,0004 e p = 0,0002, respectivamente). No grupo simulado, a BMD mediana foi de 0,0085 (MAD = 0,0007) e 0,03 (MAD = 0,001) às 6 e 12 semanas, respectivamente. No grupo macerado, a BMD mediana foi 0,0185 (MAD = 0,0007) e 0,04 (MAD = 0,001) e, no grupo picado, a BMD mediana foi 0,031 (MAD = 0,002) e 0,054 (MAD = 0,001) às 6 e 12 semanas, respectivamente ( Fig. 8 ). O teste post-hoc para comparação pareada demonstrou o incremento na regeneração óssea no grupo picado em comparação ao grupo simulado.

Fig. 8 Concentração mineral óssea (BMC) e densidade mineral óssea (BMD) por grupos e tempos.

Tabela 1 Resumo estatístico de densitometria

Variável	Semanas	Grupos	Mediana	MAD	Valor de p	
BMC	3				0.00038150651248	
		Simulado	0,002	0		
		Picado	0,009	0,0007413		
		Macerado	0,005	0		
BMC	6				0,00067991117923	
		Simulado	0,0015	0,0007413		
		Picado	0,0055	0,0007413		
		Macerado	0,003	0		
BMC	12				0,00019298618864	
		Simulado	0,003	0		
		Picado	0,015	0,0014826		
		Macerado	0,008	0,0014826		
BMD	3				0,00048367583690	
		Simulado	0,0105	0,0014826		
		Picado	0,0415	0,0007413		
		Macerado	0,026	0,0014826		
BMD	6				0,00046850172588	
		Simulado	0,0085	0,0007413		
		Picado	0,0315	0,0022239		
		Macerado	0,0185	0,0007413		
BMD	12				0,00020323763567	
		Simulado	0,03	0,0014826		
		Picado	0,054	0,0014826		
		Macerado	0,04	0,0014826		
BMC, Conteúdo de massa óssea; BMD, conteúdo mineral ósseo, MAD, desvio absoluto da mediana.

Analisamos os parâmetros nTC nos grupos experimentais. O BV e o BV/TV estimam o volume de osso regenerado na área do defeito ósseo crítico. Observamos uma regeneração óssea global significativa nos grupos picado e macerado em comparação ao grupo simulado (p < 0.0001) ( Fig. 9 ). O BV mediano do grupo simulado às 3, 6 e 12 semanas foi de 1,4 (MAD = 0,2), 3,1 (MAD = 0,35) e 3,3 (MAD = 0,6), respectivamente. No grupo macerado, o BV mediano às 3, 6 e 12 semanas foi de 1,3 (MAD = 0,6), 5,4 (MAD = 2,1) e 4,7 (MAD = 2,3) ( Tabela 2 ).

Tabela 2 Resumo estatístico de nanotomografia

Variável	Semanas	Grupo	Mediana	Valor de p	
BV	3			0,002338	
		Simulado	3,166115		
		Picado	9,8977		
		Macerado	5,39414		
BV	6			0,0033992	
		Simulado	1,39563		
		Picado	6,83119		
		Macerado	1,30313		
BV	12			0,0013393	
		Simulado	3,29243		
		Picado	12,90203		
		Macerado	4,74866		
BV/TV	3			0,0030956	
		Simulado	1,60475		
		Picado	8,1638		
		Macerado	2,360649		
BV/TV	6			0,0029369	
		Simulado	0,622355		
		Picado	6,21231		
		Macerado	0,812585		
BV/TV	12			0,0003588	
		Simulado	1,22118		
		Picado	11,49151		
		Macerado	4,80795		
BV, Volume ósseo; TV, volume total.

Fig. 9 Volume ósseo (BV) e volume ósseo por volume total (BV/TV).

Analisamos a correlação entre a BMD e os parâmetros microestruturais obtidos por nTC e detectamos uma alta correlação positiva com BV, BV/TV e Tb.N (rho = 0,77, rho = 0,82 e rho = 0,81, respectivamente), e uma forte anticorrelação com a separação trabecular e a porosidade total (rho = -0,73 e rho = -0,82, respectivamente).

A análise biomecânica inferiu o comportamento da neoformação óssea sob testes de estresse. Medimos a força máxima, a deformação, a rigidez relativa e a resistência máxima à elasticidade de cada amostra de crânio. Observamos que os espécimes de crânio de ratos submetidos ao enxerto com osso picado foram significativamente mais resistentes ao estresse ( Tabela 3 ) (p < 0,0001 para todas as variáveis). A força máxima mediana geral (MAD), a deformação, a rigidez relativa e a resistência máxima à elasticidade no grupo picado foram de 36 (19,9), 2,6 (0,8), 12,5 (5,5) e 39,1 (20,5), respectivamente, em comparação a 10,1 (4), 1,39 (0,3), 6,8 (3) e 6,8 (2,8) no grupo simulado e 13,1 (9,2), 1,9 (1), 4,7 (3) e 14,6 (11) no grupo macerado ( Fig. 10 ).

Fig. 10 Resistência máxima (N) e deformação (mm).

Tabela 3 Resumo estatístico de testes biomecânicos

Variável	Semanas	Grupo	Mediana	Valor de p	
Resistência máxima	3			0,002338	
		Simulado	8,375		
		Picado	34,54		
		Macerado	13,06		
Resistência máxima	6			0,006104	
		Simulado	11		
		Picado	36,77		
		Macerado	10,92		
Resistência máxima	12			0,003498	
		Simulado	10,56		
		Picado	35,99		
		Macerado	14,075		
Deformação	3			0,041776	
		Simulado	1,44		
		Picado	2,415		
		Macerado	2,965		
Deformação	6			0,010158	
		Simulado	1,32		
		Picado	2,565		
		Macerado	1,39		
Deformação	12			0,014718	
		Simulado	1,13		
		Picado	2,64		
		Macerado	2,185		

Discussão

Os defeitos ósseos representam desafios relevantes para os ortopedistas. 1 2 3 4 19 20 Os tratamentos de defeitos ósseos críticos muitas vezes geram complicações. 4 5 6 Há também uma associação com recuperação prolongada e diminuição da qualidade de vida. 21

O sucesso do enxerto ósseo é limitado por muitos fatores, como a capacidade de remodelação do hospedeiro, o próprio material, a técnica cirúrgica 22 e até mesmo a forma de manuseio do enxerto. 23 24 O autoenxerto é o tratamento mais utilizado para defeitos ósseos, mas ainda não está claro qual técnica de preparo induz maior regeneração. 8 24 25 Está bem estabelecido que as dimensões do enxerto influenciam o resultado do tratamento 26 27 28 e o crânio já foi descrito como a área doadora, 29 mas, até onde sabemos, não houve um estudo comparando preparações de enxerto ósseo autólogo local macerado e picado.

Do ponto de vista macroscópico e clínico ao microestrutural, nossos dados demonstraram a maior eficiência da preparação do enxerto ósseo picado na indução da regeneração óssea.

Macroscopicamente, detectamos maior massa óssea (densidade e conteúdo) no grupo picado em comparação aos grupos simulado e macerado em todos os desfechos (3, 6 e 12 semanas após a cirurgia). Da mesma forma, nossos testes mecânicos também confirmaram a maior eficácia do enxerto ósseo picado na indução da regeneração óssea com propriedades mais fortes. Vale ressaltar que o grupo picado apresentou ossos recém-formados com maior força máxima, rigidez e deformação, exigindo cargas maiores antes da falha e demonstrando maior módulo de elasticidade. Histologicamente, nossa análise qualitativa sugere uma porcentagem muito maior de formação óssea tecida e preenchimento de defeitos ósseos críticos nas amostras do grupo picadas do que no grupo macerado, o que pode ser confirmado microscopicamente pela avaliação por nTC. O grupo picado exibiu um efeito osteogênico notável no aumento dos parâmetros relacionados à formação de volume ósseo e fração óssea, densidade de conectividade, espessura e número trabecular, além de diminuições nos parâmetros relacionados à reabsorção, como relação superfície/volume ósseo, índice de modelo de estrutura, separação trabecular e porosidade.

É importante destacar que modelos de defeito ósseo crítico no crânio de ratos podem ser usados para o estudo de regeneração óssea e biomateriais antes de considerar animais maiores ou futuras aplicações humanas. 30 O primeiro modelo de defeito ósseo no crânio de ratos foi descrito em 1973 por Freeman e Turnbull, mas realizado por Takagi e Urist somente em 1982. Confirmamos a eficácia do nosso modelo, pois não houve regeneração óssea espontânea no grupo simulado em qualquer desfecho.

Dentre as limitações do nosso estudo, podemos incluir a falta de elucidação dos mecanismos que levam a uma melhor regeneração óssea devido ao uso do enxerto ósseo picado. Embora não tenha sido o objetivo do nosso estudo, pesquisas futuras devem incluir avaliação molecular para expandir nossa capacidade crítica e a produção científica de dados, bem como direcionar terapias farmacológicas potentes para induzir ainda mais a regeneração. A comparação entre enxerto ósseo autólogo local, enxerto ósseo autólogo distante e substitutos ósseos adjuvantes deve ser mais investigada nos processos de cicatrização óssea para alcançar o melhor tratamento possível para defeitos ósseos críticos.

Conclusão

Este estudo evidenciou que diferentes técnicas para preparo e tratamento local de defeitos ósseos podem desempenhar um papel importante na indução da regeneração óssea. Utilizamos um modelo animal de defeito ósseo sem cicatrização espontânea durante todo o experimento. Por outro lado, nossos protocolos de enxerto ósseo autólogo local induziram regeneração óssea neste modelo animal. O enxerto ósseo picado gerou ossos recém-formados com maior massa, melhor microarquitetura e melhor integridade mecânica do que os ossos recém-formados após o enxerto ósseo macerado.

Conflito de Interesses Os autores declaram não ter conflitos de interesses.

Trabalho desenvolvido no Departamento de Ortopedia e Anestesiologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, Brasil.

Work carried out at the Department of Orthopedics and Anesthesiology, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, Brazil.
==== Refs
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