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Rev Bras Ortop (Sao Paulo)
Rev Bras Ortop (Sao Paulo)
10.1055/s-00042410
Revista Brasileira de Ortopedia
0102-3616
1982-4378
Thieme Revinter Publicações Ltda. Rua do Matoso 170, Rio de Janeiro, RJ, CEP 20270-135, Brazil

10.1055/s-0043-1771531
RBO-D-22-00206
Artigo Original
Medicina do Esporte
The COL5A1 Gene Allelic Combination and ACL Injury Risk in Team Sport: A Preliminary Report
http://orcid.org/0000-0002-4225-8574
Calò Carla Maria 1
http://orcid.org/0000-0001-5726-4435
Massidda Myosotis 2
http://orcid.org/0000-0002-4513-151X
Sorge Roberto 3
http://orcid.org/0000-0002-1511-7186
Tiloca Alessandra 4
http://orcid.org/0000-0002-1469-2138
Monteleone Giovanni 5
1 Departamento de Ciências Biológicas e Ambientais, Universidade de Cagliari, Itália
2 Faculdade de Medicina e Cirurgia, Universidade de Cagliari, Itália
3 Departmento de Sistemas Médicos, Faculdade de Medicina e Cirurgia, Universidade de Roma “Tor Vergata”, Roma, Itália
4 Universidade de Roma “Tor Vergata”, Roma, Itália
5 Escola de Educação Física e Ciências do Exercício, Universidade de Roma “Tor Vergata”, Roma, Itália
Endereço para correspondência Giovanni Monteleone, Dr. Via Montpellier 1 - 00133 RomeItalygiovanni.monteleone@uniroma2.it
22 4 2024
8 2024
1 4 2024
59 4 e584e589
21 7 2022
16 12 2022
The Author(s). This is an open access article published by Thieme under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License, permitting copying and reproduction so long as the original work is given appropriate credit ( https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ )
2024
The Author(s).
https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Objective:  The aim of this study was to examine the relationship between BstUI restriction fragment length polymorphisms (RFLP) C/T (rs 12722) and DpnII RFLP B1/B2 (rs 13946) COL5A1 polymorphisms and the anterior cruciate ligament (ACL) rupture in competitive team-sport athletes.

Methods  Sixty-eight team-sport players (n = 36 women and n = 32 men) with non-contact ACL rupture (ACLR) occurred during sport practices (ACLR Group) and 42 healthy players (n = 20 women and n = 22 men) (Control Group) participated in the study. Genomic DNA was extracted from buccal swab with salting out method. All samples were genotyped for the polymorphisms rs12722 and rs13946 by polymerase chain reaction (PCR) and restriction enzymes analysis.

Results  No significant difference has been found between ACRL and Control groups in age, height, weight body, mass index, sport practice (hours/week) and gender distribution among the different team sports. Control group had longer sport careers ( p < 0.005). The frequency distributions of COL5A1 DpnII nucleotide polymorphisms were in Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) in both groups ( p of the Hardy-Weinberg (HW) -test > 0.005). Genotype frequencies of COL5A1 BstUI RFLP C/C was lower in the ACLR group compared to the Control group ( p of the HW-test = 0.001). Combined CC, B1B1 genotypes showed a protective effect against ACL rupture (OR = 83.3 / 16.7 = 5).

Conclusions  The COL5A1 gene may be one of the genetic factors associated with ACLR in team sport.

Keywords

anterior cruciate ligament
athletes
athletic injuries
polymorphism, single nucleotide
rupture
Suporte Financeiro Os autores declaram que esta pesquisa não recebeu nenhum subsídio específico de agências de financiamento nos setores público, comercial ou sem fins lucrativos. Financial Support The authors declare that this research did not receive any specific grant from funding agencies in the public, commercial, or not-for-profit sectors.
==== Body
pmcIntroduction

Anterior cruciate ligament rupture (ACLR) is a frequent disabling injury among athletes, that causes knee joint instability. In the USA, estimated incidence of ACLR ranges between 100,000 and 200,000 / year. 1 Reconstructive surgery allows sports practice and a better quality of life. In Italy, the incidence of ACL reconstruction surgery is 21-33 rate per year in 100,000 people, with an incidence between 0.16 and 2.04 procedures per 100,000 individuals younger than 15 years. 2 3

Despite surgical ligament reconstruction, about 79% of these patients develop knee osteoarthritis and 20% suffer a new injury within the next 2 years. 4

Sport ACLRs can be contact injuries (with a teammate or opponent), more frequent in contact sports such as soccer or basketball, 5 or non-contact injuries. In a 10-year period of observation, Majewski et al. 6 noted that 60% of sport knee injuries treated in their hospital were volleyball-related ACL injuries. Agel et al. 7 found that 14% of injuries in volleyball occur via non-contact.

Over a 16-year period of collegiate injuries registration, Hootman et al. 8 reported an injury rate per 1000 athlete-exposures of 0.07 and 0.09 for male basket and soccer players. They report 0.23, 0.28 and 0.09 for female basket, soccer and volleyball players respectively.

The risk factors for ACL injury are classified as exogenous (e.g. laying surface) and endogenous like genetic factors. 9 In inheritable collagen disorders, genetics influence laxity of tissues 10 : generalized joint laxity and hyperextension were found to significantly increase the risk for ACL injury in female athletes. 11 Mutations within the COL5A1 gene cause the classic form of Ehlers-Danlos syndrome (EDS) characterized by joint hypermobility involved in sprains, dislocation / subluxation, and early osteoarthritis. 12 As reported by Mokone et al. 13 , the COL5A1 gene contains RFLP of BstUI (rs 12722) and DpnII (rs13946) within its 3'-untranslated region (UTR). The functional COL5A1 specificity protein 1 (Sp1) binding site polymorphism - BstUI RFLP C / T is positively correlated with tendon and ligament injuries, especially in Caucasian subjects. 14 15 Accordingly, a study on soccer players found that the T/T genotype of the COL5A1 BstUI RFLP showed a trend toward a higher severity of musculoskeletal injuries with respect to the individual carriers of the CC genotype. 15

The aim of this study was to correlate the COL5A1 gene BstUI RFLP and DpnII RFLP polymorphisms with ACLR in volleyball, basketball and soccer athletes.

Materials and Methods

Subjects

68 Caucasic players (n = 36 women and n = 32 men) with ACLR occurred during sport practices (ACLR Group) and 42 healthy players (n = 20 women and n = 22 men) (Control Group) participated to the study. All of them practiced team-sports (Volleyball, Basketball, and Soccer) in Italian teams. Subjects gave informed consent to participate. To obtain demographic information and data regarding sport practice; each athlete completed a self-administered questionnaire. The ACLR Group (32 athletes practiced Volleyball, 19 Basketball and 17 Soccer) provided information on the mechanisms and date of anterior cruciate ligament injury.

The study was approved by the Institutional Review Board of the University of Cagliari (Prot. PG/2017/1700) and was carried out in accordance with the ethical and humane principles of the research.

DNA Analysis

Genomic DNA was extracted from buccal swab, performed on the oral mucosa of the cheek, through salting out method, and amplified by standard PCR following the protocol suggested by Galasso et al. 16

PCR products were subjected to two enzymatic digestions: digestion with BstUI produced two fragments for the T allele (351 and 316 bp) and three fragments for C allele (316, 271, and 80 bp); digestion with DpnII produced a unique fragment for B2 (612 bp) and two fragments (412 and 194 bp) for B1. The fragments obtained were separated through an 8% polyacrylamide gels for BstUI and a 2% agarose gel for DpnII and visualized with Syber Safe staining.

Statistical Analysis

All data were initially entered into an Excel database (Microsoft, Redmond, Washington – United States) and the analysis was performed using the Statistical Package for the Social Sciences Windows, version 15.0 (SPSS, Chicago, Illinois, USA). Descriptive statistics consisted of the mean ± standard deviation (SD) for parameters with gaussian distributions (after confirmation with histograms and the Kolgomorov-Smirnov test).

Comparison among groups was performed with the ANOVA one-way for continuous parametric variables or the Chi-square test or Fisher's exact test (if cells < 5) for frequencies variables.

HWE tests were conducted considering population frequencies (p2 + 2pq + q2 = 1) and then reported in SPSS, Chi-square nonparametric test. Similarly, the G-square test (G 2 test) was performed. A p value of < 0.05 was considered statistically significant.

Results

No significant difference has been found between ACRL and Control groups in age, height, weight body mass index, sport practice (hours/week) and gender distribution among the different team-sports). Control Group athletes have longer sport careers ( p < 0.005) ( Table 1 ).

Table 1 Characteristics of the of the ACL rupture Group (ACLR) and Control Group

	ACLR	Control	p	
Number	68	42		
Age (years)	27.3 ± 6.4	28.5 ± 8.5	0.406*	
Height (cm)	173.0 ± 9.5	174.0 ± 11.4	0.588*	
Weight (kg)	70.0 ± 11.8	70.2 ± 12.3	0.945*	
Body mass index (kg/cm 2 )	23.30 ± 3.30	23.16 ± 2.99	0.782*	
Gender (n°males/n°females)	32 / 36	22 / 20	0.200^	
Sports (Volleyball; Basketball; Soccer)	32; 19; 17	26; 8; 8	0.312^	
SPORT (years)	10.8 ± 4.9	16.8 ± 8.5	0.001*	
SPORT (hours/week)	7.7 ± 3.2	7.8 ± 4.0	0.799*	
Values are expressed as mean ± standard deviation or a number (n) where applicable.

(*) Anova oneway (^) Chi-Square test.

The genotype and allele frequencies of COL5A1 BstUI RFLPC/T and COL5A1 DpnII RFLP B1/B2 are shown in Table 2 . Genotype frequency distributions of COL5A1 DpnII and COL5A1 BstUI RFLP nucleotide polymorphisms meet the HWE in both groups ( p . value > 0.05).

Table 2 Genotype Frequencies of the ACLR Group and Control Group - Hardy-Weinberg equilibrium verification

BstU	ACLR	Control	
CC	58.90	22.22	
CT	34.25	44.44	
TT	6.85	33.33	
MAF (T)	0.2397	0.5556	
p	0.3881	0.3274*	
DpnII	ACL	Control	
B1B1	71.23	75.56	
B1B2	26.03	20.00	
B2B2	2.74	4.44	
MAF (B2)	0.15	0.1444	
p	0.556	0.2060*	
(*) Hardy-Weinberg equilibrium test.

Linkage disequilibrium was tested with LDlink (Machiela and Chanock, 2015) 17 using data from 1000 genomes (1000 Genomes Project Consortium, 2015). The two single nucleotide polymorphisms (SNPs) resulted in a linkage disequilibrium for European populations.

The distribution of the C/C genotype and the C allele of the COL5A1 BstUI RFLP were lower in the ACLR Group compared with the Control Group ( p G 2 test= 0.001- Table 3 ). No significant differences have been found in the distribution of the DpnII RFLP polymorphism between ACLR Group and controls ( Table 3 ). Finally, the combination of CC + B1B1 genotypes was more frequent in the controls than in the ACLR group, and associated with a protective effect (OR = 83.3 / 16.7 = 5). The TT, B2B2 genotypes were absent among participants.

Table 3 Genotype Frequencies of the ACLR Group and Control Group

ACLR		Control	p	
COL5A1 BstUI% (CC; CT; TT)	23,8;61,0; 79,2 (0.954)	76,2; 39,0; 20,8 (0.368)	0.001°	
COL5A1 DpnII% (B1B1; B1B2; B2B2)	60,8;66,7; 50,0 (0.990)	39,2;33, 3; 50,0 (0.497)	0.952°	
(°) Chi-Square test.

Discussion

Although the biological changes underlying the increased risk of ACL sports injury have not yet been find out, the family predisposition of athletes to ACL ruptures is a consolidated knowledge. 18 19

The COL5A1 gene, located at 9q34.2-q34.3, contains 66 exons distributed over 150 kb of gDNA, and it encodes the 1 chain of type V collagen. 20

The COL5A1 gene codes for a protein chain in type V collagen, which is found in ligaments and tendons, and mutations within it are indicated as a cause responsible for the increased risk of ACL rupture. 19 21

We examined the association between COL5A1 rs12722 C / T (BstUI RFLP) and COL5A1 rs13946 B1/B2 (DpnII) polymorphisms individually and as haplotypes with risk of anterior cruciate ligament rupture in male and female athletes competing in contact / noncontact team sports.

Our results show a lower frequency of the COL5A1 BstUI C/C genotype in the ACLR group compared with the Control Group. No significant differences in genotype distribution or allele frequencies of COL5A1 DpnII was observed.

Posthumus et al. 21 found an underrepresented C/C genotype of COL5A1 BstUI RFLP in Caucasian females but not in males with surgically diagnosed ACL ruptures recruited from sports and recreational clubs.

In male recreational skiers, Stępień-Słodkowska et al. 22 noted no significant differences in genotype distribution or allele frequencies of COL5A1 BstUI RFLP C/T (rs 12722) and COL5A1 DpnII RFLP C/T (rs 13946) polymorphisms between the ACLR group and control group. These authors found an underrepresentation tendency of the C-T haplotype in the ACLR group compared to controls.

Luliska-Kuklik et al. 23 found a significant decrease in frequency in the dominant model of the C/C genotype for the COL5A1 rs13946 gene in male professional soccer players with surgically diagnosed primary ACL rupture.

In our study, athletes within the ACLR and control groups were matched for age, height, body weight, BMI, sport, and length of their sport career. The longer is the sport career the higher is the risk of trauma exposure.

In addition to having a higher frequency of the C/C genotype, the athletes in the Control Group have a longer sports career than those of the ACLR Group: with caution due to the small number of subjects, we hypothesize a protective effect of the C/C genotype, especially if associated with B1B1 (CC, B1B1 OR protective = 83.3 / 16.7 = 5).

Likewise, Posthumus et al. 24 found a significant age dependent increase in the distribution of the COL5A1 BstUI RFLP C/C genotype in a group of physical activity male, asymptomatic for musculoskeletal soft-tissue injuries (without a reported history of tendon injuries). According to these authors, prolonging exposure time to extrinsic risk of injury selects individuals who are genetically low risk of injury, who will be found in greater numbers among older asymptomatic subjects than in the younger asymptomatic subjects.

The COL5A1 BstUI RFLP C/C polymorphism may play a role in increasing the length of the sports career of athletes.

It is unclear which phenotypic expression of COL5A1 gene polymorphisms may be associated with an increased risk of ACL rupture.

In EDS, several COL5A1 gene mutations occur concurrently with specific clinical features. 10 The connective tissue of these patients shows structural changes and ligamentous laxity causing different degrees of joint hypermobility.

Hypermobility has been implicated in ACL injury, 25 and lower limb joint proprioception is reduced in those with benign joint hypermobility syndrome 26 : no correlation has been described between the COL5A1 BstUI RFLP and COL5A1 DpnII polymorphisms with an increase in ligamentous laxity. Future investigations should include the search for an association between changes in joint mobility or ligament tension and the presence of these polymorphisms.

In a retrospective genetic case-control association study, O'Connell et al. 27 found the COL5A1 C/C genotype significantly overrepresented in triathlon and ultra-marathon athlete without a history of exercise-associated muscle cramping (EAMC) compared with athletes with a history of EAMC. The efficiency of the knee flexor muscles, the abductors muscles of the hip and trunk stabilizers muscles efficiency prevent ACL injuries. 28

According to Collins and Posthumus, 29 the COL5A1 rs12722 TT genotype is associated with a surplus V collagen production with a higher risk of some musculoskeletal injuries due to collagen fibril structural changes in collagen fibrils and changes in the properties of soft tissues.

Laguette et al. 30 demonstrated greater stability of the COL5A1 mRNA (encoding for α1(V)) in C/T genotype and speculated that small changes in COL5A1 mRNA stability, even if within the normal physiological range, could result in inter-individual variation in fibrillogenesis; therefore, a different vulnerability to musculoskeletal lesions COL5A1-dependent. We theorize that, in the study group (ACLR Group), the frequent exposure of the ACL to abnormal stresses during team sport practice, reveals the relative susceptibility of the ACL of the athletes with C/T genotype.

As reported by Smith et al., 19 tree more genetic factors may be associated with an increase in ligament fragility: 1) TT genotype of the COL1A1 Sp1, binding site polymorphism. The COL1A1 gene encodes a protein chain within type I collagen, a major structural component of ligaments; 2) the AA genotype of the COL12A1 AluI polymorphism (only in women). This gene encodes for protein chains in type XII collagen, which is believed to regulate fibril diameter in ligaments; 3) the chromosomal region 11q22, where several matrix metalloproteinase genes of physiologic mediators of collagen cleavage and removal are located.

Multiple genetic dependency of ACL susceptibility to rupture may suggest scanning changes in multiple genes.

The main limitation of the present work is represented by the small number of athletes included in the study, which has precluded the possibility of analyzing any differences between genders. The development of clinical or laboratory tools which identify subjects at great risk to this common musculoskeletal injury, would ease a greater people awareness of their own exposure to an ACL rupture. Besides it would be useful in settle the best therapeutic choice after primary ACL rupture diagnosis.

Conclusions

The COL5A1 gene may be one of the genetic factors associated with ACLR in team-sport. COL5A1 C/C polymorphisms provides a protective effect against the ACLR in both sex. Longer sport career linked to an increased frequency of COL5A1 BstUI RFLP C/C.

Contribuições dos Autores

Authors' Contributions

Gene COL5A1 e o risco de lesões do LCA no esporte de equipe: Um relatório preliminar
Resumo

Objetivo:  O objetivo deste estudo foi examinar a relação entre os polimorfismos do comprimento do fragmento de restrição (RFLP) BstUI C/T (rs 12722) e RFLP DpnII B1/B2 (rs 13946) COL5A1 e a ruptura do ligamento cruzado anterior (LCA) em atletas de esportes coletivos.

Métodos  Sessenta e oito atletas de esportes coletivos (n = 36 mulheres e n = 32 homens) com ruptura do LCA (RLCA) sem contato ocorreram durante práticas esportivas (Grupo RLCA) e 42 jogadores saudáveis (n = 20 mulheres e n = 22 homens) (Grupo Controle) participaram do estudo. O DNA genômico foi extraído do swab bucal com o método salting out. Todas as amostras foram genotipadas para os polimorfismos rs12722 e rs13946 por reação em cadeia da polimerase (PCR) e análise de enzimas de restrição.

Resultados  Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre os grupos RLCA e Controle em idade, altura, peso corporal, índice de massa, prática esportiva (horas/semana) e distribuição de gênero entre os diferentes esportes coletivos. O grupo controle teve carreiras esportivas mais longas (p< 0,005). As distribuições de frequência dos polimorfismos de nucleotídeos COL5A1 DpnII estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) em ambos os grupos (p do teste de Hardy-Weinberg (HW) > 0,005). As frequências genotípicas de COL5A1 BstUI RFLP C/C foram menores no grupo RLCA em comparação com o grupo Controle (p do teste HW = 0,001). Os genótipos combinados CC, B1B1 mostraram um efeito protetor contra a ruptura do LCA (OR = 83,3 / 16,7 = 5).

Conclusões  O gene COL5A1 pode ser um dos fatores genéticos associados à RLCA em esportes coletivos.

Palavras-chave

atletas
ligamento cruzado anterior
polimorfismo de nucleotídeo único
ruptura
traumatismos em atletas
Introdução

A ruptura do ligamento cruzado anterior (RLCA) é uma lesão incapacitante frequente em atletas, que causa instabilidade articular do joelho. Nos EUA, a incidência estimada de RLCA varia entre 100.000 e 200.000/ano. 1 A cirurgia reconstrutiva permite a prática desportiva e uma melhor qualidade de vida. Na Itália, a incidência de cirurgia de reconstrução do LCA é de 21-33 por ano a cada 100.000 pessoas, com incidência entre 0,16 e 2,04 procedimentos por 100.000 indivíduos menores de 15 anos. 2 3

Apesar da reconstrução cirúrgica do ligamento, cerca de 79% desses pacientes desenvolvem osteoartrite do joelho e 20% sofrem uma nova lesão nos próximos 2 anos. 4

As RLCA esportivas podem ser lesões de contato (com um companheiro de equipe ou adversário), mais frequentes em esportes de contato como futebol ou basquete, 5 ou lesões sem contato. Em um período de observação de 10 anos, Majewski et al. 6 observaram que 60% das lesões esportivas do joelho tratadas em seu hospital eram lesões do LCA relacionadas ao voleibol. Agel et al. 7 constataram que 14% das lesões no voleibol ocorrem por não contato.

Ao longo de um período de 16 anos de registro de lesões colegiais, Hootman et al. 8 relataram uma taxa de lesões por 1.000 exposições de atletas de 0,07 e 0,09 para jogadores masculinos de basquete e futebol. Eles relatam 0,23, 0,28 e 0,09 para jogadores de basquete, futebol e vôlei, respectivamente.

Os fatores de risco para lesão do LCA são classificados como exógenas (por exemplo, a superfície) e endógenas, como fatores genéticos. 9 Em distúrbios hereditários do colágeno, a genética influencia a frouxidão dos tecidos 10 : frouxidão ligamentar generalizada e hiperextensão demonstraram aumentar significativamente o risco de lesão do LCA em atletas do sexo feminino. 11 Mutações no gene COL5A1 causam a forma clássica da síndrome de Ehlers-Danlos (SED), caracterizada por hipermobilidade articular envolvida em entorses, luxação/subluxação e osteoartrite precoce. 12 Conforme descrito por Mokone et al. 13 , o gene COL5A1 contém RFLP de BstUI (rs 12722) e DpnII (rs13946) dentro de sua região não traduzida (UTR) 3'. O polimorfismo funcional do sítio de ligação da proteína 1 (Sp1) de especificidade COL5A1 - BstUI RFLP C / T está positivamente correlacionado com lesões tendíneas e ligamentares, especialmente em indivíduos caucasianos. 14 15 Assim, um estudo com jogadores de futebol descobriu que o genótipo T/T do COL5A1 BstUI RFLP mostrou uma tendência a uma maior gravidade das lesões musculoesqueléticas em relação aos portadores individuais do genótipo CC. 15

O objetivo deste estudo foi correlacionar os polimorfismos BstUI RFLP e DpnII RFLP do gene COL5A1 com ACLR em atletas de voleibol, basquete e futebol.

Materiais e métodos

Participantes

Participaram do estudo 68 jogadores caucasianos (n = 36 mulheres e n = 32 homens) com RLCA ocorrido durante a prática esportiva (Grupo RLCA) e 42 jogadores saudáveis (n = 20 mulheres e n = 22 homens) (Grupo Controle). Todos praticavam esportes coletivos (vôlei, basquete e futebol) em times italianos. Os indivíduos deram consentimento informado para participar. Para a obtenção de informação demográfica e dados relativos à prática desportiva, cada atleta completou um questionário autoaplicável. O Grupo RLCA (32 atletas praticantes de Voleibol, 19 Basquetebol e 17 Futebol) forneceu informações sobre os mecanismos e data da lesão do LCA.

O estudo foi aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa da Universidade de Cagliari (Prot. PG/2017/1700) e foi realizado de acordo com os princípios éticos e humanos da pesquisa.

Análise de DNA

O DNA genômico foi extraído de swab bucal, realizado na mucosa oral da bochecha, pelo método salting out, e amplificado por PCR padrão seguindo o protocolo sugerido por Galasso et al. 16

Os produtos de PCR foram submetidos a duas digestões enzimáticas: a digestão com BstUI produziu dois fragmentos para o alelo T (351 e 316 pb) e três fragmentos para o alelo C (316, 271 e 80 pb); a digestão com DpnII produziu um único fragmento para B2 (612 pb) e dois fragmentos (412 e 194 pb) para B1. Os fragmentos obtidos foram separados em gel de poliacrilamida 8% para BstUI e gel de agarose 2% para DpnII e visualizados com coloração Syber Safe.

Análise estatística

Todos os dados foram inicialmente inseridos em um banco de dados Excel (Microsoft, Redmond, Washington – Estados Unidos) e a análise foi realizada por meio do Statistical Package for the Social Sciences Windows, versão 15.0 (SPSS, Chicago, Illinois, EUA). A estatística descritiva consistiu na média ± desvio padrão (DP) para parâmetros com distribuição gaussiana (após confirmação com histogramas e teste de Kolgomorov-Smirnov).

A comparação entre os grupos foi realizada com ANOVA one-way para variáveis paramétricas contínuas ou teste Qui-quadrado ou teste exato de Fisher (se células <5) para variáveis de frequências.

Os testes EHW foram realizados considerando as frequências populacionais (p2 + 2pq + q2 = 1) e posteriormente relatados no SPSS, teste não paramétrico Qui-quadrado. Da mesma forma, o teste G-quadrado (teste G2) foi realizado. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre os grupos RLCA e Controle em idade, altura, peso, índice de massa corporal, prática esportiva (horas/semana) e distribuição de gênero entre os diferentes esportes coletivos). Os atletas do Grupo de controle têm carreiras esportivas mais longas (p < 0,005) ( Tabela 1 ).

Tabela 1 Características do Grupo com ruptura do LCA (RLCA) e Grupo Controle

	RLCA	Controle	p	
Número	68	42		
Idade (anos)	27.3 ± 6.4	28.5 ± 8.5	0.406*	
Altura (cm)	173.0 ± 9.5	174.0 ± 11.4	0.588*	
Peso (kg)	70.0 ± 11.8	70.2 ± 12.3	0.945*	
Índice de massa corporal (kg/cm 2 )	23.30 ± 3.30	23.16 ± 2.99	0.782*	
Sexo (n° masculino/n° feminino)	32 / 36	22 / 20	0.200^	
Esportes (vôlei; basquete; futebol)	32; 19; 17	26; 8; 8	0.312^	
ESPORTE (anos)	10.8 ± 4.9	16.8 ± 8.5	0.001*	
ESPORTE (horas/semana)	7.7 ± 3.2	7.8 ± 4.0	0.799*	
Os valores são expressos como média ± desvio padrão ou um número (n) quando aplicável.

(*) Teste qui-quadrado Anova unidirecional (^).

As frequências genotípicas e alélicas de COL5A1 BstUI RFLPC/T e COL5A1 DpnII RFLP B1/B2 são mostradas na Tabela 2 . As distribuições de frequência genotípica dos polimorfismos de nucleotídeos COL5A1 DpnII e COL5A1 BstUI RFLP atendem ao EHW em ambos os grupos (p. valor> 0,05).

Tabela 2 Frequências Genotípicas do Grupo RLCA e do Grupo Controle - Verificação do Equilíbrio de Hardy-Weinberg

BstU	RLCA	Controle	
CC	58.90	22.22	
CT	34.25	44.44	
TT	6.85	33.33	
MAF (T)	0.2397	0.5556	
p	0.3881	0.3274*	
DpnII	RLCA	Controle	
B1B1	71.23	75.56	
B1B2	26.03	20.00	
B2B2	2.74	4.44	
MAF (B2)	0.15	0.1444	
p	0.556	0.2060*	
(*) Teste de Equilíbrio de Hardy-Weinberg.

O desequilíbrio de ligação foi testado com LDlink (Machiela e Chanock, 2015) 17 usando dados de 1000 genomas (1000 Genomes Project Consortium, 2015). Os dois polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) resultaram em um desequilíbrio de ligação para as populações europeias.

A distribuição do genótipo C/C e do alelo C do COL5A1 BstUI RFLP foi menor no Grupo RLCA em comparação com o Grupo Controle (teste pG2= 0.001- Tabela 3 ). Não foram encontradas diferenças significativas na distribuição do polimorfismo DpnII RFLP entre o Grupo RLCA e os controles ( Tabela 3 ). Finalmente, a combinação dos genótipos CC + B1B1 foi mais frequente nos controles do que no grupo RLCA, e associada a um efeito protetor (OR = 83,3 / 16,7 = 5). Os genótipos TT, B2B2 estavam ausentes entre os participantes.

Tabela 3 Frequências Genotípicas do Grupo RLCA e do Grupo Controle

RLCA		Controle	p	
COL5A1 BstUI% (CC; CT; TT)	23,8;61,0; 79,2 (0.954)	76,2; 39,0; 20,8 (0.368)	0.001°	
COL5A1 DpnII% (B1B1; B1B2; B2B2)	60,8;66,7; 50,0 (0.990)	39,2;33, 3; 50,0 (0.497)	0.952°	
(°) Teste qui-quadrado.

Discussão

Embora as alterações biológicas subjacentes ao aumento do risco de lesão esportiva do LCA ainda não tenham sido descobertas, a predisposição genética de atletas para rupturas do LCA é um conhecimento consolidado. 18 19

O gene COL5A1, localizado em 9q34.2-q34.3, contém 66 exons distribuídos em 150 kb de gDNA e codifica a cadeia 1 do colágeno tipo V. 20

O gene COL5A1 codifica uma cadeia proteica no colágeno tipo V, que se encontra em ligamentos e tendões, e mutações dentro dele são apontadas como causa responsável pelo aumento do risco de ruptura do LCA. 19 21

Examinamos a associação entre os polimorfismos COL5A1 rs12722 C/T (BstUI RFLP) e COL5A1 rs13946 B1/B2 (DpnII) individualmente e como haplótipos com risco de ruptura do ligamento cruzado anterior em atletas masculinos e femininos competindo em esportes coletivos de contato/sem contato.

Nossos resultados mostram uma frequência menor do genótipo COL5A1 BstUI C/C no Grupo RLCA em comparação com o grupo Controle. Nenhuma diferença significativa na distribuição de genótipos ou frequências alélicas de COL5A1 DpnII foi observada.

Posthumus et al. 21 encontraram um genótipo C/C sub-representado de COL5A1 BstUI RFLP em mulheres caucasianas, mas não em homens com rupturas de LCA diagnosticadas cirurgicamente recrutados de clubes esportivos e recreativos.

Em esquiadores amadores do sexo masculino, Stępień-Słodkowska et al. 22 não observaram diferenças significativas na distribuição genotípica ou nas frequências alélicas dos polimorfismos C/T C/T COL5A1 BstUI RFLP (rs 12722) e COL5A1 DpnII RFLP (rs 13946) entre o grupo RLCA e o grupo controle. Esses autores encontraram uma tendência de sub-representação do haplótipo C-T no grupo RLCA em comparação aos controles.

Luliska-Kuklik et al. 23 encontraram uma diminuição significativa na frequência no modelo dominante do genótipo C/C para o gene COL5A1 rs13946 em jogadores profissionais de futebol do sexo masculino com ruptura primária do LCA diagnosticada cirurgicamente.

Em nosso estudo, os atletas dos grupos RLCA e controle foram pareados por idade, altura, peso corporal, IMC, esporte e duração de sua carreira esportiva. Quanto mais longa a carreira esportiva, maior o risco de exposição ao trauma.

Além de apresentar maior frequência do genótipo C/C, os atletas do Grupo Controle têm uma carreira esportiva mais longa do que os do Grupo RLCA: com cautela devido ao pequeno número de sujeitos, hipotetizamos um efeito protetor do C Genótipo /C, especialmente se associado a B1B1 (CC, B1B1 OR protetor = 83,3 / 16,7 = 5).

Da mesma maneira, Posthumus et al. 24 encontraram um aumento significativo dependente da idade na distribuição do genótipo COL5A1 BstUI RFLP C/C no Grupo de atividade física do sexo masculino, assintomático para lesões musculoesqueléticas de tecidos moles (sem histórico relatado de lesões tendíneas). Segundo esses autores, prolongar o tempo de exposição ao risco extrínseco de lesão seleciona indivíduos geneticamente de baixo risco de lesão, que serão encontrados em maior número entre os assintomáticos mais velhos do que nos assintomáticos mais jovens.

O polimorfismo COL5A1 BstUI RFLP C/C pode desempenhar um papel no aumento da duração da carreira esportiva dos atletas.

Não está claro qual expressão fenotípica dos polimorfismos do gene COL5A1 pode estar associada a um risco aumentado de ruptura do LCA.

Na SED, várias mutações do gene COL5A1 ocorrem simultaneamente com características clínicas específicas. 10 O tecido conjuntivo desses pacientes apresenta alterações estruturais e frouxidão ligamentar causando diferentes graus de hipermobilidade articular.

A hipermobilidade tem sido implicada na lesão do LCA, 25 e a propriocepção articular dos membros inferiores é reduzida naqueles com síndrome de hipermobilidade articular benigna 26 : nenhuma correlação foi descrita entre os polimorfismos COL5A1 BstUI RFLP e COL5A1 DpnII com aumento da frouxidão ligamentar. Investigações futuras devem incluir a busca de uma associação entre alterações na mobilidade articular ou tensão ligamentar e a presença desses polimorfismos.

Em um estudo retrospectivo de associação caso-controle genético, O'Connell et al. 27 encontraram o genótipo COL5A1 C/C significativamente super-representado em atletas de triátlon e ultramaratona sem histórico de cãibras musculares associadas ao exercício (CMAE) em comparação com atletas com histórico de CMAE. A eficiência dos músculos flexores do joelho, dos músculos abdutores do quadril e dos músculos estabilizadores do tronco previne lesões do LCA. 28

De acordo com Collins and Posthumus, 29 o genótipo COL5A1 rs12722 TT está associado a uma produção excedente de colágeno V com maior risco de algumas lesões musculoesqueléticas devido a alterações estruturais das fibrilas de colágeno nas fibrilas de colágeno e alterações nas propriedades dos tecidos moles.

Laguette et al. 30 demonstraram maior estabilidade do mRNA COL5A1 (codificando para α1(V)) no genótipo C/T e especularam que pequenas mudanças na estabilidade do mRNA COL5A1, mesmo que dentro da faixa fisiológica normal, poderiam resultar em variação interindividual na fibrilogênese; portanto, uma vulnerabilidade diferente a lesões musculoesqueléticas dependentes de COL5A1. Teorizamos que, no grupo de estudo (Grupo RLCA), a frequente exposição do LCA a estresses anormais durante a prática de esportes coletivos revela a suscetibilidade relativa do LCA dos atletas com genótipo C/T.

Conforme relatado por Smith et al., 19 mais três fatores genéticos podem estar associados ao aumento da fragilidade ligamentar: 1) genótipo TT do COL1A1 Sp1, polimorfismo do sítio de ligação. O gene COL1A1 codifica uma cadeia de proteína dentro do colágeno tipo I, um importante componente estrutural dos ligamentos; 2) o genótipo AA do polimorfismo COL12A1 AluI (somente em mulheres). Esse gene codifica as cadeias de proteína no colágeno tipo XII, que se acredita regular o diâmetro das fibrilas nos ligamentos; 3) a região cromossômica 11q22, onde estão localizados vários genes de metaloproteinases da matriz de mediadores fisiológicos da clivagem e remoção do colágeno.

A dependência genética múltipla da susceptibilidade à ruptura do LCA pode sugerir alterações de varredura em múltiplos genes.

A principal limitação do presente trabalho é representada pelo pequeno número de atletas incluídos no estudo, o que impossibilitou a análise de diferenças entre os gêneros. O desenvolvimento de ferramentas clínicas ou laboratoriais que identifiquem indivíduos com grande risco para essa lesão musculoesquelética comum, facilitaria uma maior conscientização das pessoas sobre sua própria exposição a uma ruptura do LCA. Além disso, seria útil para definir a melhor escolha terapêutica após o diagnóstico de ruptura primária do LCA.

Conclusões

O gene COL5A1 pode ser um dos fatores genéticos associados à RLCA em esportes coletivos. Os polimorfismos COL5A1 C/C fornecem um efeito protetor contra RLCA em ambos os sexos. Carreira esportiva mais longa ligada a uma frequência aumentada de COL5A1 BstUI RFLP C/C.

Conflito de Interesses Os autores não têm conflito de interesses a declarar.

Cada autor contribuiu individual e significativamente para o desenvolvimento deste artigo: CMC - Concepção do estudo, contribuiu com a coleta e revisão de dados; MM - Contribuiu com a análise, revisão e edição dos dados; RS - Análise estatística de dados; AT - Recrutamento de atletas e consultoria técnica desportiva; GM - Preparação do rascunho original. Revisão e edição.

Trabalho desenvolvido na Universidade de Cagliari, Itália, Universidade de Roma “Tor Vergata”, Roma, Itália.

Each author contributed individually and significantly to the development of this article: CMC - Design of the study, contributed to data collection;

MM contributed to data collection and review.

AT - Athletes recruitment and technical sports consulting; GM - Original draft preparation. Review and editing.

Work carried out at the University of Cagliari, Italy, University of Rome “Tor Vergata”, Rome, Italy.
==== Refs
Referências

1 Wiggins A J Grandhi R K Schneider D K Stanfield D Webster K E Myer G D Risk of Secondary Injury in Younger Athletes After Anterior Cruciate Ligament Reconstruction: A Systematic Review and Meta-analysis Am J Sports Med 2016 44 07 1861 1876 26772611
2 Longo U G Nagai K Salvatore G Epidemiology of Anterior Cruciate Ligament Reconstruction Surgery in Italy: A 15-Year Nationwide Registry Study J Clin Med 2021 10 02 223 33435155
3 Longo U G Salvatore G Ruzzini L Trends of anterior cruciate ligament reconstruction in children and young adolescents in Italy show a constant increase in the last 15 years Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc 2021 29 06 1728 1733 32772142
4 Nessler T Denney L Sampley J ACL Injury Prevention: What Does Research Tell Us? Curr Rev Musculoskelet Med 2017 10 03 281 288 28656531
5 Montalvo A M Schneider D K Webster K E Anterior Cruciate Ligament Injury Risk in Sport: A Systematic Review and Meta-Analysis of Injury Incidence by Sex and Sport Classification J Athl Train 2019 54 05 472 482 31009238
6 Majewski M Susanne H Klaus S Epidemiology of athletic knee injuries: A 10-year study Knee 2006 13 03 184 188 16603363
7 Agel J Rockwood T Klossner D Collegiate ACL Injury Rates Across 15 Sports: National Collegiate Athletic Association Injury Surveillance System Data Update (2004-2005 Through 2012-2013) Clin J Sport Med 2016 26 06 518 523 27315457
8 Hootman J M Dick R Agel J Epidemiology of collegiate injuries for 15 sports: summary and recommendations for injury prevention initiatives J Athl Train 2007 42 02 311 319 17710181
9 Pfeifer C E Beattie P F Sacko R S Hand A Risk factors associated with non-contact anterior cruciate ligament injury: a systematic review Int J Sports Phys Ther 2018 13 04 575 587 30140551
10 Bowen J M Sobey G J Burrows N P Ehlers-Danlos syndrome, classical type Am J Med Genet C Semin Med Genet 2017 175 01 27 39 28192633
11 Hewett T E Myer G D Ford K R Paterno M V Quatman C E Mechanisms, prediction, and prevention of ACL injuries: Cut risk with three sharpened and validated tools J Orthop Res 2016 34 11 1843 1855 27612195
12 Syx D De Wandele I Rombaut L Malfait F Hypermobility, the Ehlers-Danlos syndromes and chronic pain Clin Exp Rheumatol 2017 35 (5, Suppl 107)116 122
13 Mokone G G Schwellnus M P Noakes T D Collins M The COL5A1 gene and Achilles tendon pathology Scand J Med Sci Sports 2006 16 01 19 26 16430677
14 Lv Z T Gao S T Cheng P Association between polymorphism rs12722 in COL5A1 and musculoskeletal soft tissue injuries: a systematic review and meta-analysis Oncotarget 2017 9 20 15365 15374 29632650
15 Massidda M Bachis V Corrias L Piras F Scorcu M Calò C M Influence of the COL5A1 rs12722 on musculoskeletal injuries in professional soccer players J Sports Med Phys Fitness 2015 55 11 1348 1353 25583227
16 Galasso O Iaccino E Gallelli L Collagen type V polymorphism in spontaneous quadriceps tendon ruptures Orthopedics 2012 35 04 e580 e584 22495864
17 Machiela M J Chanock S J LDlink: a web-based application for exploring population-specific haplotype structure and linking correlated alleles of possible functional variants Bioinformatics 2015 31 21 3555 3557 26139635
18 Flynn R K Pedersen C L Birmingham T B Kirkley A Jackowski D Fowler P J The familial predisposition toward tearing the anterior cruciate ligament: a case control study Am J Sports Med 2005 33 01 23 28 15610995
19 Smith H C Vacek P Johnson R J Risk factors for anterior cruciate ligament injury: a review of the literature - part 1: neuromuscular and anatomic risk Sports Health 2012 4 01 69 78 23016072
20 Malfait F Wenstrup R J De Paepe A Clinical and genetic aspects of Ehlers-Danlos syndrome, classic type Genet Med 2010 12 10 597 605 20847697
21 Posthumus M September A V O'Cuinneagain D van der Merwe W Schwellnus M P Collins M The COL5A1 gene is associated with increased risk of anterior cruciate ligament ruptures in female participants Am J Sports Med 2009 37 11 2234 2240 19654427
22 Stępień-Słodkowska M Ficek K Kaczmarczyk M The Variants Within the COL5A1 Gene are Associated with Reduced Risk of Anterior Cruciate Ligament Injury in Skiers J Hum Kinet 2015 45 103 111 25964814
23 Lulińska-Kuklik E Rahim M Domańska-Senderowska D Interactions between COL5A1 Gene and Risk of the Anterior Cruciate Ligament Rupture J Hum Kinet 2018 62 65 71 29922378
24 Posthumus M September A V O'Cuinneagain D van der Merwe W Schwellnus M P Collins M The association between the COL12A1 gene and anterior cruciate ligament ruptures Br J Sports Med 2010 44 16 1160 1165 19443461
25 Wolf J M Cameron K L Owens B D Impact of joint laxity and hypermobility on the musculoskeletal system J Am Acad Orthop Surg 2011 19 08 463 471 21807914
26 Smith T O Jerman E Easton V Do people with benign joint hypermobility syndrome (BJHS) have reduced joint proprioception? A systematic review and meta-analysis Rheumatol Int 2013 33 11 2709 2716 23728275
27 O'Connell K Posthumus M Schwellnus M P Collins M Collagen genes and exercise-associated muscle cramping Clin J Sport Med 2013 23 01 64 69 22894972
28 Mehl J Diermeier T Herbst E Evidence-based concepts for prevention of knee and ACL injuries. 2017 guidelines of the ligament committee of the German Knee Society (DKG) Arch Orthop Trauma Surg 2018 138 01 51 61 28983841
29 Collins M Posthumus M Type V collagen genotype and exercise-related phenotype relationships: a novel hypothesis Exerc Sport Sci Rev 2011 39 04 191 198 21697718
30 Laguette M J Abrahams Y Prince S Collins M Sequence variants within the 3′-UTR of the COL5A1 gene alters mRNA stability: implications for musculoskeletal soft tissue injuries Matrix Biol 2011 30 (5-6):338 345 21609763
