
==== Front
Rev Bras Ortop (Sao Paulo)
Rev Bras Ortop (Sao Paulo)
10.1055/s-00042410
Revista Brasileira de Ortopedia
0102-3616
1982-4378
Thieme Revinter Publicações Ltda. Rua do Matoso 170, Rio de Janeiro, RJ, CEP 20270-135, Brazil

10.1055/s-0044-1787767
RBO-D-23-00224
Artigo Original
Coluna
Electrical Stimulation Prevents Muscular Atrophy and the Decrease of Interleukin-6 in Paralyzed Muscles after Spinal Cord Injury in Rats
http://orcid.org/0000-0003-4355-4428
Machado-Pereira Nicolas A. M. M. 1
http://orcid.org/0000-0001-5209-3761
do Nascimento Patrícia S. 2
http://orcid.org/0000-0002-5519-0767
de Freitas Gabriel R. 1
http://orcid.org/0000-0002-3537-1712
Bobinski Franciane 3
http://orcid.org/0000-0001-8657-9532
do Espírito Santo Caroline C. 4
http://orcid.org/0000-0002-6300-4696
Ilha Jocemar 1
1 Núcleo de Pesquisa em Lesão da Medula Espinal (NULEME), Departamento de Fisioterapia, Centro de Ciências da Saúde e do Esporte (CEFID), Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC), Florianópolis, SC, Brasil
2 Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Centro de Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil
3 Laboratório Experimental de Neurociências (LANEX), Universidade do Sul de Santa Catarina (UNISUL), Palhoça, SC, Brasil
4 Instituto Internacional de Neurociências Edmond e Lily Safra (IIN-ELS), Macaíba, RN, Brasil
Endereço para correspondência Jocemar Ilha, PT, PhD Núcleo de Pesquisa em Lesão da Medula Espinal (NULEME), Departamento de Fisioterapia, Centro de Ciências da Saúde e do Esporte (CEFID), Universidade do Estado de Santa CatarinaRua Pascoal Simone 358–Coqueiros, Florianópolis, SC, 88080-350Braziljocemar.ilha@udesc.br
04 9 2024
8 2024
1 9 2024
59 4 e526e531
23 8 2023
20 2 2024
The Author(s). This is an open access article published by Thieme under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License, permitting copying and reproduction so long as the original work is given appropriate credit ( https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ )
2024
The Author(s).
https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Objective  To analyze the muscle trophism and expression of interleukin-6 in the biceps brachii muscle of rats with incomplete cervical spinal cord injury treated with neuromuscular electrical stimulation (NMES).

Methods  Adult rats underwent C5-C7 spinal cord hemisection and a 5-week NMES protocol. Trophism of the biceps brachii was assessed using muscle weight/body weight ratio and histological analysis. Interleukin-6 expression from biceps brachii was measured using the enzyme-linked immunosorbent assay technique.

Results  Preservation of the biceps brachii muscle trophism was found in the NMES treated group, along with prevention of the reduction of interleukin-6 levels.

Conclusion  Spinal cord injury causes muscle atrophy and decreases interleukin-6 levels. These alterations are partially prevented by NMES. The results suggest a possible NMES action mechanism and underscore the clinical use of this therapeutic tool.

Keywords

electric stimulation therapy
interleukin-6
muscular atrophy
paralysis
rehabilitation
spinal cord injury
Suporte Financeiro Os autores declaram que este estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Estado de Santa Catarina (FAPESC) (TO 2023TR501) e pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES; Código de Financiamento 001). Financial Support This study has been funded by the Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação e Inovação do Estado de Santa Catarina (FAPESC) (TO 2023TR501) and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES; Finance Code 001).
==== Body
pmcIntroduction

Spinal cord injury (SCI) is a clinical condition resulting mainly from trauma. 1 It disrupts the neural inputs between the spinal cord's upper and lower regions, impairing motor, sensory, and autonomous function below the injury level. Muscular paresis/paralysis is the most pronounced motor impairment after a SCI, being able to provoke an imbalance between anabolism and catabolism of several proteins, leading to protein breakdown or poor protein synthesis. 2

This protein breakdown may lead to several health concerns, such as hormonal changes, cardiovascular diseases, overweight and muscle loss. 3 4 Moreover, the protein imbalance causes changes in muscle fiber type, 5 promoting the reduction of fatigue resistance and reduced ability to generate force, 6 cross-sectional area and muscle weight due to loss of myofibrillar proteins, organelles, and cytoplasmic content. 7 8 9

The atrophy grade was pronounced in humans 1 to 4 months after SCI, with preferential type II muscle fibers atrophy. Additionally, a predominant type I fiber atrophy was seen in the later stage of the SCI (7–10 months). 10 11 Muscle atrophy and transformation of type I and II muscle fibers into type IIx leads to increased fatigue of these muscles. 12

Similarly, animal models have shown muscle atrophy after induced SCI. 13 14 In rats, 5 days after SCI, there is a decreased muscle fiber cross-sectional area of the soleus and extensor digitorum longus muscles. 11 The cross-sectional area continues to decrease for about 3 months after injury. 12 Additionally, there is reduced muscle strength 2 days after SCI, analyzed by grip test. 15

There is a range of strength and muscle mass gain treatments is available in clinical practice. Even so, neuromuscular electrical stimulation (NMES) is the treatment with the highest level of evidence for paralyzed and partially paralyzed muscles. Some studies have shown the benefits of electrically-induced involuntary muscle contraction in trophism and pointed out possible biological mechanisms underlying NMES in individuals with SCI 16 17 and animal models. 15 18 Recently, Freitas et al. 15 reported that in rats with SCI, the protein kinase B (Akt) pathway could be activated during involuntary muscle contraction by early application of NMES.

It is well established that the activation of Akt is the main pathway that leads to protein synthesis and hypertrophy after voluntary and functional electrical stimulation-induced muscle contraction, inducing muscle growth. 15 16 17 However, the involvement of the other molecules still needs to be investigated, such as the interleukin-6 (IL-6).

During and after active muscle contraction/voluntary exercise, the IL-6 is produced and released locally in muscle fiber and also released into the bloodstream, acting on muscle metabolism, glucose uptake, body heat production, promoting lipolysis and acting on the increase of muscle mass, 19 by activation of the phosphatidylinositol 3-kinase and possible activation of the Akt pathway contributing with muscle hypertrophy. 5

Within this context, IL-6 can be considered a stimulation factor of muscular trophism. However, it is unknown if involuntary electrically-induced repeated contractions of skeletal muscle can release IL-6 and prevent atrophy following a cervical SCI. Therefore, this study aims to analyze the muscular trophism and expression of IL-6 in the biceps brachii muscle of rats with cervical SCI treated early with NMES.

Materials and Methods

Adult female Wistar rats aged 3 months were divided into the following groups: a) surgical simulation (sham; n = 5); b) untreated SCI (n = 5); and c) SCI treated with NMES (n = 5). The rats were anaesthetized with ketamine (87 mg/kg) and xylazine (12 mg/kg). Then, a laminectomy of the C5-C7 vertebrae and right-side spinal cord hemisection was performed using microscissors, except for the sham animals. 15 20

In this study, we had a mortality rate of 40% for all causes. There were 8 animals lost during the surgical procedure (32%) under anesthesia, mainly due to uncontrolled hemorrhages or respiratory failure, and 2 animals were lost during the 5-week intervention (8%) due to excessive sedation and respiratory fail. Procedures have been approved by the Committee for Care and Use of Animals of the local institution (protocol: PP00745).

After the surgical procedure, the animals were kept in clean, temperature-controlled boxes with water and food. They were evaluated twice daily to identify any suffering/pain or signs of urinary infection. The manual bladder emptying procedure was performed two or three times a day, and intraperitoneal antibiotics (Baytril 65 mg/kg) were administered to prevent and treat any possible infection in the first few days after the induced SCI until the animals recovered their bladder capacity.

For treatment protocol, the Neurodyn portable device (Ibramed, Amparo, SP, Brazil) was used with animals under 5% isoflurane inhalation anesthesia, starting 48 hours after the SCI. The protocol followed a regimen of 10 minutes per session, once a day, 5 days a week, with a total therapy time of 5 weeks. 15 A trichotomy of the anterosuperior part of the right forelimb was performed to place the electrodes on the skin, aiming for the biceps brachii muscle stimulation. The electrical stimulation parameters were asymmetric biphasic pulses, pulse duration of 150 µs and stimulation frequency of 50 Hz. The intensity was regularly adjusted to produce effective muscle contraction of visualizing complete elbow flexion.

Evaluation of Muscular Trophism

After 5 weeks of treatment, the animals were euthanized, and the right biceps brachii muscle was dissected and weighed on a FA-2104 N precision scale –(Bioprecisa, Curitiba, PR, Brazil) to calculate muscle trophism measured by the ratio: muscle weight/animal weight. The muscle was sectioned longitudinally in the middle, and one part was frozen in liquid nitrogen and stored at -70°C for later biochemical analysis. The other part was separated for histological analysis.

Histological Analysis

The muscle samples were immersed in 0.1 M phosphate buffered saline (PBS) containing 4% paraformaldehyde for 18 hours. Then, the muscle was immersed in 30% nitric acid for 48 hours and transferred to a 50% glycerol solution. 7 After that, four muscle fibers from each animal were placed on histological gelatinized slides, dehydrated in increasing series of ethanol concentrations (70, 90, and 100%, for 2 minutes each), immersed in xylol for 30 seconds and covered with Permount (Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA) and coverslip.

Images of the fibers were captured with a Biological O400S 17MBO500RS (Opticam, São José dos Campos, SP, Brazil) optical microscope, with 1,000x magnification coupled with a HD212, 1920 × 1080p camera (AmScope, Irvine, CA, USA) and the AmScope software (AmScope), v3.7.9229. For the qualitative analysis, three images of each fiber were randomly selected from at least two animals per group. A blind evaluator performed the descriptive analysis of these images regarding the diameter of the fibers and the length of the sarcomeres.

Biochemical Analysis

The IL-6 levels were measured using a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) according to the manufacturer's instructions (DuoSet ELISA R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Muscle protein levels were estimated by interpolation from a standard curve using colorimetric measurements at 450 nm (wavelength correction = 540 nm) on an Apollo-8 LB 912 ELISA plate reader (Berthold Technologies GmbH & Co KG, Bad Wildbad, Germany). All results were expressed as pg/mg protein.

Statistical Analysis

Results of the muscle weight/animal weight ratio and IL-6 levels were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA). The Tukey post hoc test was used for comparisons between groups. The significance level was 95% ( p  < 0.05). All analyses were performed using the IBM SPSS Statistics for Windows (IBM Corp., Armonk, NY, USA) software, version 20.0.

Results

NMES Prevents Muscle Atrophy

The untreated SCI group showed a reduction in muscle trophism (0.051 ± 0.002 g) when compared to the sham group (0.061 ± 0.001 g; p  < 0.05). However, the NMES treated group (0.062 ± 0.001 g) showed similar values to the sham group, both being higher than the untreated group ( p  < 0.05; Fig. 1 ).

Fig. 1 Effects of NMES for 5 weeks on the biceps brachii muscle trophism after 36 days of SCI. * p  < 0.05 compared to the sham group; and # p  < 0.05 compared to the treated group. Values are expressed as the mean and standard error of the mean.

Furthermore, according to the observational analysis of the muscle fibers under the light microscope, the transverse striations of all groups are presented in series and in an organized way. However, it is possible to verify that there is a decrease in the diameter and length of the sarcomeres of the muscle fibers in both untreated and NMES treated SCI groups compared to the sham group. On the other hand, there was a partial recovery in the NMES treated group, which is not as evident in the untreated group. It was observed that the diameter and length of the sarcomere in the NMES treated group were similar to the fibers of the sham group, evidencing a reduction in the loss of muscular trophism ( Fig. 2 ).

Fig. 2 Histological images from the biceps brachii muscle. ( A ) Sham group, ( B ) untreated group, ( C ) NMES treated group, (Dm) diameter, (Sar) sarcomere. The black square is shown zoomed on the side. The black bar represents a space of 10µm.

NMES Prevents the Decrease of IL-6

There was a decrease in expression of IL-6 in the untreated group (22.5 ± 3.6) compared to the sham group (36.6 ± 4.5; p  < 0.05). However, the values of the NMES treated group (28.6 ± 2.2) were similar to both sham and untreated groups, evidencing partial preservation of the IL-6 expression in the NMES treated SCI group ( Fig. 3 ).

Fig. 3 Effects of 5 weeks NMES on the expression levels of the Interleukin-6 from the biceps brachii muscle after 36 days of SCI. * p  < 0.05 compared to the sham group. Values are expressed as the mean and standard error of the mean.

Discussion

This study showed that applying NMES for 5 weeks prevents biceps brachii muscle atrophy after incomplete cervical SCI. Additionally, this therapy prevents loss in IL-6 levels, a potential stimulation factor of muscular trophism. Few studies assessed muscle trophism in rodents with SCI treated with NMES. 15 18 Additionally, no other study investigated the release and role of myokines, such as IL-6, in paralyzed muscles following NMES in a SCI model.

However, previous studies have shown the effects of NMES on muscle trophism after a complete or incomplete SCI model. Butezloff et al. 18 showed that the treated group (NMES for 4 weeks) had 54% more muscle mass in gastrocnemius than the untreated group. Additionally, this same study showed a decrease in the number and size of muscle fibers in rats with complete SCI by surgical transection of the spinal cord at the T10 level. Hayashi et al. 21 showed that 4 weeks of daily percutaneous electrical muscle stimulation promoted a significant improvement in motor function and an increase of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels in both muscles and in the injury site in an incomplete SCI model, with contusion injury at the T9 level in rats. Moreover, de Freitas et al. 15 evidenced an increase of about 15% in muscle trophism of the biceps brachii muscle after 5 weeks of electrical stimulation in rats in a model of incomplete SCI by a spinal cord hemisection at the C5-C7 level in rats. Our data corroborate these results, showing about 17% more muscle mass in the treated injured animals than the untreated ones.

Our study also showed a reduction in the size of sarcomeres from both untreated and treated SCI groups. However, NMES partially recovered these characteristics once they were similar to sham animals. These findings indicate that electrically induced muscle contraction can prevent muscle atrophy caused by SCI and maintain the architectural features of muscle fibers.

Several studies have shown that IL-6 released during active exercise stimulates the activation of satellite cells, leading to increased muscle mass and consequent muscle hypertrophy. 6 22 Thus, during strength training, IL-6 is produced in large amounts at the local level, being considered an essential regulator in muscle satellite cell proliferation and myonuclear agglomeration, characterizing a biochemical-signaling pattern that stimulates muscle hypertrophy. 22 23

In our study, a decrease in local levels of IL-6 expression was found in paralyzed muscle after SCI, and involuntary muscle contraction elicited by electrostimulation for a short period could prevent this reduction. Bustamante et al. 24 showed that depolarization of skeletal muscle cells induces not only expression of IL-6 mediated by adenosine triphosphate (ATP) signaling but also cytokine secretion to the extracellular medium. Furthermore, this expression depends on an IP3-derived Ca signal, 2 acting as an early step to promote a positive IL-6 loop via the Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3 (JAK2/STAT3) pathway.

Additionally, several studies have reported that IL-6 can interact with the Akt pathway and regulate glycogen synthesis, thus acting in muscle trophism. 8 25 Moreover, IL-6 is released within the muscle with low glycogen levels. Therefore, muscle contraction and energy consumption are essential for its regulation, which arises by activating Ca 2+ nuclear factor of activated T cells (NFAT) and glycogen-P38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways.

It is known that type I muscle fibers are converted to type II after SCI. 12 This process has been reported within weeks in rats, and NMES can partially prevent this in the hindlimbs. 26 Our findings indicate that this prevention may have occurred in the forelimbs of rats with IL-6 participating in this process. However, some gaps remain, like the possibility of IL-6 being released by electrically induced muscle contraction inhibiting the catabolic pathway of trophism, whether there is an association between IL-6 levels and the number of type I muscle fibers, or whether another myosin participates in the process of maintaining muscle trophism and the characteristics of muscle fibers and their underlying mechanisms.

Liang et al. 27 showed that ex-vivo IL-6 released from skeletal muscles is type-specific, meaning treatment with a cytokine secretion stimulant cocktail induces a robust IL-6 release from the soleus, a typical slow oxidative muscle, and the same treatment was not able to cause a detectable release from the extender digitorum longus (a typical fast glycolytic muscle). However, as previously reported in SCI, 12 the type I muscle fibers are converted into type II, corroborating with the decreasing IL-6 in those fast glycolytic muscles. As expected, in the current study, we showed decreasing muscle IL-6 in SCI rats, and the NMES could prevent this decrease.

Additionally, other interleukins may be involved in muscle trophism beside IL-6, such as the leukemia inhibitory factor (LIF), a member of the IL–6 cytokine superfamily that has multiple biological functions. The LIF protein is secreted from human-cultured myotubes. When electrically stimulated, it causes satellite cell proliferation. It has been demonstrated that both IL-6 and LIF activate myotube mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) signaling in a time- and dose-dependent fashion. 28

Conclusion

This study indicates that early NMES can prevent muscle atrophy and preserve the characteristics of muscle fibers in the biceps brachii after an incomplete SCI model. Moreover, the NMES partially maintained the reduction of IL-6 levels after injury in this muscle. We suggest that the NMES induced IL-6 release, possibly activating the satellite cells and increasing the phosphorylated Akt levels. However, further studies are required to elucidate the subsequent mechanisms of NMES on paralyzed muscles after SCI.

A estimulação elétrica previne a atrofia muscular e a diminuição da interleucina-6 em músculos paralisados após lesão da medula espinal em ratos
Resumo

Objetivo  Analisar o trofismo muscular e a de interleucina-6 no músculo bíceps braquial de ratas com lesão medular cervical incompleta tratados com estimulação elétrica neuromuscular (EENM).

Métodos  Ratas adultas foram submetidas à hemissecção da medula espinal em C5-C7 e a um protocolo de EENM de 5 semanas. O trofismo do bíceps braquial foi avaliado pela relação peso muscular/peso corporal e análise histológica. A expressão de interleucina-6 no bíceps braquial foi medida usando ensaio de imunoabsorção enzimática.

Resultados  O grupo tratado com EENM apresentou preservação do trofismo muscular, assim como prevenção da redução dos níveis de interleucina-6.

Conclusão  A lesão da medula espinal causa atrofia muscular e diminui a expressão de interleucina-6. Essas alterações são parcialmente prevenidas pela EENM. Os resultados sugerem um possível mecanismo de ação da EENM e ressaltam o uso clínico desta ferramenta terapêutica.

Palavras-chave

atrofia muscular
interleucina-6
paralisia
reabilitação
terapia por estimulação elétrica
traumatismos da medula espinal
Introdução

A lesão da medula espinal (LME) é uma condição clínica resultante principalmente de traumas. 1 Ela interrompe as entradas neurais entre as regiões superior e inferior da medula espinal, prejudicando a função motora, sensorial e autônoma abaixo do nível da lesão. A paresia/paralisia muscular é o comprometimento motor mais pronunciado após a LME, podendo provocar um desequilíbrio entre o anabolismo e o catabolismo de diversas proteínas, levando à degradação ou má síntese proteica muscular. 2

Essa degradação de proteínas pode levar a diversos problemas de saúde, como alterações hormonais, doenças cardiovasculares, excesso de peso e perda muscular. 3 4 Além disso, o desequilíbrio proteico altera o tipo de fibra muscular, 5 promovendo a redução da resistência à fadiga, da capacidade de gerar força, 6 da área de secção transversal e do peso muscular devido à perda de proteínas miofibrilares, organelas e conteúdo citoplasmático. 7 8 9

A atrofia foi pronunciada em humanos 1 a 4 meses após a LME, afetando preferencialmente as fibras musculares do tipo II. Além disso, uma atrofia predominante das fibras do tipo I foi observada no estágio posterior da LME (7–10 meses). 10 11 Atrofia muscular e a transformação das fibras musculares do tipo I e II em tipo IIx aumentam a fatiga desses músculos. 12

Da mesma forma, modelos animais mostraram atrofia muscular após a LME induzida. 13 14 Em ratos, 5 dias após a LME, houve diminuição da área transversal da fibra muscular dos músculos sóleo e extensor longo dos dedos. 11 A área transversal continua a diminuir por cerca de 3 meses após a lesão. 12 Além disso, há redução da força muscular 2 dias após a LME ao teste de preensão. 15

Há uma gama de tratamentos para ganho de força e massa muscular na prática clínica. Ainda assim, a estimulação elétrica neuromuscular (EENM) é o tratamento com maior nível de evidência para músculos com paralisia parcial ou completa. Alguns estudos mostraram os benefícios da contração muscular involuntária induzida eletricamente no trofismo e apontaram possíveis mecanismos biológicos subjacentes à EENM em indivíduos com LME 16 17 e modelos animais. 15 18 Recentemente, de Freitas et al. 15 relataram que, em ratos com LME, a via da proteína quinase B (Akt) poderia ser ativada durante a contração muscular involuntária pela aplicação precoce de EENM.

Está bem estabelecido na literatura que a ativação de Akt é a principal via que leva à síntese e hipertrofia proteica após a contração muscular voluntária e induzida pela estimulação elétrica funcional, levando ao crescimento muscular. 15 16 17 No entanto, o envolvimento de outras moléculas, como a interleucina-6 (IL-6), ainda precisa ser investigado.

Durante e após a contração muscular ativa/exercício voluntário, há produção e liberação local de IL-6 na fibra muscular. A IL-6 também é liberada na corrente sanguínea, atuando no metabolismo muscular, captação de glicose, produção de calor corporal, promoção de lipólise e aumento da massa muscular 19 pela ativação da fosfatidilinositol 3-quinase e possível ativação da via Akt como contribuinte da hipertrofia muscular. 5

Dentro deste contexto, a IL-6 pode ser considerada um fator de estimulação do trofismo muscular. No entanto, não se sabe se contrações repetidas involuntárias do músculo esquelético por indução elétrica podem liberar IL-6 e prevenir a atrofia após uma LME cervical. Portanto, este estudo tem como objetivo analisar o trofismo muscular e os níveis de expressão de IL-6 no músculo bíceps braquiais de ratos com LME cervical submetidos ao tratamento precoce com EENM.

Materiais e Métodos

Ratas adultas Wistar com 3 meses de idade foram divididos nos seguintes grupos: a) simulação cirúrgica ( sham ; n = 5); b) sem tratamento (n = 5); e c) LME tratada com EENM (n = 5). As ratas foram anestesiadas com cetamina (87 mg/kg) e xilazina (12 mg/kg). Em seguida, foi realizada laminectomia das vértebras C5-C7 e hemissecção medular direita com microtesoura, exceto nos animais do grupo sham . 15 20

No presente estudo, a taxa de mortalidade por todas as causas foi de 40%. Houve 8 mortes de animais durante o procedimento cirúrgico (32%) sob anestesia, principalmente devido a hemorragias não controladas ou insuficiência respiratória e 2 animais morreram durante o período de intervenção de 5 semanas (8%) devido à sedação excessiva e insuficiência respiratória. Os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da instituição local (protocolo: PP00745).

Após o procedimento cirúrgico, os animais foram mantidos em caixas limpas, com temperatura controlada, água e ração. Os animais foram avaliados duas vezes ao dia para identificação de sofrimento/dor ou sinais de infecção urinária. O procedimento de esvaziamento vesical manual foi realizado duas ou três vezes ao dia e um antibiótico (Baytril, 65 mg/kg) foi administrado por via intraperitoneal para prevenir e tratar qualquer possível infecção nos primeiros dias após a indução da LME até que os animais recuperassem a capacidade vesical.

O protocolo de tratamento utilizou o aparelho portátil Neurodyn (Ibramed Amparo, SP, Brasil) com animais sob anestesia inalatória com isoflurano a 5%, a partir de 48 horas após a LME. O protocolo seguiu um regime de 10 minutos por sessão, uma vez ao dia, 5 dias por semana, com tempo total de terapia de 5 semanas. 15 Foi realizada tricotomia da parte anterosuperior do membro torácico direito para colocação dos eletrodos na pele, visando a estimulação do músculo bíceps braquial. Os parâmetros de estimulação elétrica foram pulsos bifásicos assimétricos, duração de pulso de 150 µs e frequência de estimulação de 50 Hz. A intensidade foi ajustada regularmente para produzir contração muscular eficaz e visualizar a flexão completa do cotovelo.

Avaliação do Trofismo Muscular

Após 5 semanas de tratamento, os animais foram eutanasiados e o músculo bíceps braquial direito foi dissecado e pesado na balança de precisão FA-2104 N (Bioprecisa, Curitiba, PR, Brasil) para cálculo do trofismo muscular medido pela razão entre os pesos muscular e do animal. O músculo foi seccionado longitudinalmente no meio e uma parte foi congelada em nitrogênio líquido e armazenada a -70° C para posterior análise bioquímica. A outra parte foi separada para análise histológica.

Análise Histológica

As amostras musculares foram imersas em salina tamponada com fosfato a 0,1 M contendo paraformaldeído a 4% por 18 horas. Em seguida, o músculo foi imerso em ácido nítrico 30% por 48 horas e transferido para solução de glicerol a 50%. 7 Quatro fibras musculares de cada animal foram colocadas em lâminas histológicas gelatinizadas, desidratadas em séries crescentes de concentrações de etanol (70, 90 e 100%, por 2 minutos cada), imersos em xilol por 30 segundos e cobertos com Permount (Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, EUA) e lamínula.

As imagens das fibras foram capturadas com o microscópio óptico Biological O400S 17MBO500RS (Opticam, São José dos Campos, SP, Brasil) com ampliação de 1.000x acoplado a uma câmera HD212, 1920 × 1080p (AmScope, Irvine, CA, EUA) e software AmScope (AmScope), v3.7.9229. Para a análise qualitativa, três imagens de cada fibra foram selecionadas aleatoriamente de pelo menos dois animais por grupo. Um avaliador sem conhecimento dos grupos de animais realizou a análise descritiva dessas imagens quanto ao diâmetro das fibras e ao comprimento dos sarcômeros.

Análise Bioquímica

Os níveis de IL-6 foram medidos utilizando um ensaio de imunoabsorção enzimática ( enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA, em inglês) em sanduíche de acordo com as instruções do fabricante (DuoSet ELISA R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA). Os níveis de proteína muscular foram estimados por interpolação a partir de uma curva-padrão obtida por medidas colorimétricas a 450 nm (correção de comprimento de onda = 540 nm) em um leitor de placas de ELISA Apollo-8 LB 912 (Berthold Technologies GmbH & Co KG, Bad Wildbad, Alemanha). Todos os resultados foram expressos como pg/mg de proteína.

Análise Estatística

Os resultados da relação peso muscular/peso do animal e dos níveis de IL-6 foram analisados por análise de variância ( analysis of variance , ANOVA, em inglês) unidirecional. O teste post hoc de Tukey foi utilizado para comparações entre grupos. O nível de significância foi de 95% ( p  < 0,05). Todas as análises foram realizadas no programa IBM SPSS Statistics for Windows (IBM Corp., Armonk, NY, EUA), versão 20.0.

Resultados

Prevenção da Atrofia Muscular por EENM

O grupo LME não tratado apresentou redução no trofismo muscular (0,051 ± 0,002 g) em comparação ao grupo sham (0,061 ± 0,001 g; p  < 0,05). Porém, o grupo tratado com EENM (0,062 ± 0,001 g) apresentou valores semelhantes ao grupo sham , ambos sendo superiores ao grupo não tratado ( p  < 0,05; Fig. 1 ).

Fig. 1 Efeitos da estimulação elétrica neuromuscular (EENM) por 5 semanas no trofismo do músculo bíceps braquial após 36 dias da lesão da medula espinal (LME). * p  < 0,05 em comparação ao grupo de simulação cirúrgica ( sham ); e # p  < 0,05 em comparação ao grupo tratado. Os valores são expressos como média e erro-padrão da média.

Além disso, de acordo com a análise observacional das fibras musculares à microscopia óptica, as estrias transversais de todos os grupos estavam em série e organizadas. Porém, era possível verificar que uma diminuição no diâmetro e comprimento dos sarcômeros das fibras musculares tanto no grupo LME não tratado quanto no grupo tratado com EENM em comparação ao grupo sham . Por outro lado, houve uma recuperação parcial no grupo tratado, o que não é tão evidente no grupo não tratado. Observou-se que o diâmetro e o comprimento do sarcômero no grupo tratado foram semelhantes aos observados nas fibras do grupo sham , evidenciando a redução na perda de trofismo muscular ( Fig. 2 ).

Fig. 2 Imagens histológicas do músculo bíceps braquial. ( A ) Grupo de simulação cirúrgica ( sham ), ( B ) grupo não tratado, ( C ) grupo tratado com EENM, (Dm) diâmetro, (Sar) sarcômero. O quadrado preto mostra a imagem em maior aumento. A barra preta representa um espaço de 10 µm.

Prevenção da Redução de IL-6 por EENM

Houve diminuição na expressão de IL-6 no grupo não tratado (22,5 ± 3,6) em comparação ao grupo sham (36,6 ± 4,5; p  < 0,05). No entanto, os valores do grupo tratado com EENM (28,6 ± 2,2) foram semelhantes aos grupos sham e não tratado, evidenciando preservação parcial da expressão de IL-6 no grupo submetido ao tratamento (EENM) ( Fig. 3 ).

Fig. 3 Efeitos da EENM por 5 semanas nos níveis de expressão de interleucina-6 do músculo bíceps braquial após 36 dias de lesão da medula espinal (LME). * p  < 0,05 em comparação ao grupo de simulação cirúrgica ( sham ). Os valores são expressos como média e erro-padrão da média.

Discussão

Este estudo mostrou que a aplicação da EENM por 5 semanas previne a atrofia do músculo bíceps braquial após a LME cervical incompleta. Além disso, esse tratamento previne a perda da expressão de IL-6, um possível fator de estimulação do trofismo muscular. Poucos estudos avaliaram o trofismo muscular em roedores com LME tratados com EENM. 15 18 Além disso, nenhum outro estudo investigou a liberação e o papel de miocinas, como a IL-6, em músculos paralisados após EENM em um modelo de LME.

No entanto, estudos anteriores mostraram os efeitos da EENM no trofismo muscular em um modelo de LME completo ou incompleto. Butezloff et al. 18 mostraram que o grupo tratado (EENM por 4 semanas) apresentou 54% mais massa muscular no gastrocnêmio que o grupo não tratado. Além disso, este mesmo estudo mostrou uma diminuição no número e tamanho das fibras musculares em ratos com LME completa por transecção cirúrgica da medula espinal no nível de T10. Hayashi et al. 21 mostraram que 4 semanas de estimulação elétrica muscular percutânea diária promoveram uma melhora significativa na função motora e um aumento nos níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro ( brain-derived neurotrophic fator , BDNF, em inglês) em ambos os músculos e no sítio da lesão em um modelo de LME incompleta, com lesão por contusão no nível T9 em ratos. Além disso, de Freitas et al. 15 evidenciaram um aumento de cerca de 15% no trofismo muscular do músculo bíceps braquial após 5 semanas de estimulação elétrica em ratos em um modelo de LME incompleta por hemissecção da medula espinal no nível C5-C7 em ratos. Nossos dados corroboram esses resultados, mostrando um aumento de cerca de 17% de massa muscular nos animais com LME tratados em comparação aos não tratados.

Nosso estudo também mostrou uma redução no tamanho dos sarcômeros nos grupos de LME com e sem tratamento. No entanto, a EENM recuperou parcialmente essas características, uma vez que os resultados foram semelhantes aos dos animais do grupo sham . Esses achados indicam que a contração muscular induzida eletricamente pode prevenir a atrofia muscular causada pela LME e manter as características arquitetônicas das fibras musculares.

Diversos estudos demonstraram que a IL-6 liberada durante o exercício ativo estimula a ativação de células-satélites, levando ao aumento da massa muscular e consequente hipertrofia muscular. 6 22 Assim, durante o treinamento de força, a IL-6 é produzida em grandes quantidades em nível local, sendo considerada um regulador essencial na proliferação de células-satélites musculares e na aglomeração mionuclear, caracterizando um padrão de sinalização bioquímica que estimula a hipertrofia muscular. 22 23

Nosso estudo detectou uma diminuição nos níveis locais de expressão de IL-6 no músculo paralisado após a LME e que a contração muscular involuntária provocada pela eletroestimulação por um curto período poderia prevenir essa redução. Bustamante et al. 24 mostraram que a despolarização das células musculares esqueléticas induz não apenas a expressão de IL-6 mediada pela sinalização de trifosfato de adenosina ( adenosine triphosphate , ATP, em inglês), mas também a secreção de citocinas para o meio extracelular. Além disso, essa expressão depende de um sinal de Ca 2 derivado de IP3, atuando como um passo inicial para promover uma alça positiva de IL-6 através da via Janus quinase 2/transdutor de sinal e ativador de transcrição 3 ( Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3 , JAK2/STAT3, em inglês).

Ademais, vários estudos relataram que a IL-6 pode interagir com a via Akt e regular a síntese de glicogênio, atuando no trofismo muscular. 8 25 Além disso, IL-6 também é liberada dentro do músculo com baixos níveis de glicogênio. Portanto, a contração muscular e o consumo de energia são essenciais para sua regulação, derivada da ativação das vias Ca 2+ -fator nuclear de células T ativadas ( nuclear factor of activated T cells , NFAT, em inglês) e glicogênio-P38 proteína quinase ativada por mitógeno ( mitogen-activated protein kinase , MAPK, em inglês).

Sabe-se que as fibras musculares do tipo I são convertidas em tipo II após a LME. 12 Esse processo foi relatado em semanas em ratos e a EENM pode prevenir isso parcialmente nos membros posteriores. 26 Nossos achados indicam que essa prevenção pode ter ocorrido nos membros anteriores de ratos com participação de IL-6. No entanto, ainda há algumas lacunas, como a possibilidade de a IL-6 ser liberada pela contração muscular induzida eletricamente e inibindo a via catabólica do trofismo, se existe uma associação entre os níveis de IL-6 e o número de fibras musculares do tipo I, ou se outra miosina participa do processo de manutenção do trofismo muscular e das características das fibras musculares e seus mecanismos subjacentes.

Liang et al. 27 mostraram que a IL-6 liberada ex vivo dos músculos esqueléticos é específica do tipo de fibra muscular, ou seja, o tratamento com um coquetel estimulante da secreção de citocinas induz uma liberação robusta de IL-6 pelo sóleo, um músculo oxidativo lento típico, mas o mesmo tratamento não foi capaz de causar uma liberação detectável do extensor longo dos dedos (um típico músculo glicolítico rápido). Porém, como relatado anteriormente na LME, 12 as fibras musculares do tipo I são convertidas em tipo II, corroborando com a diminuição da IL-6 nesses músculos glicolíticos rápidos. Como esperado, no presente estudo, mostramos diminuição da IL-6 muscular em ratos com LME, e a EENM poderia prevenir essa diminuição.

Além disso, outras interleucinas além da IL-6 podem estar envolvidas no trofismo muscular, como o fator inibitório da leucemia (LIF), um membro da superfamília de citocinas IL-6 com múltiplas funções biológicas. A proteína LIF é secretada por miotubos humanos em cultura. Após a estimulação elétrica, ela causa a proliferação de células-satélites. Foi demonstrado que tanto a IL-6 quanto a LIF ativam a sinalização do alvo mecanicista do complexo 1 de rapamicina ( mammalian target of rapamycin complex 1 , mTORC1, em inglês) do miotubo de forma dependente do tempo e da dose. 28

Conclusão

Este estudo indica que a EENM precoce pode prevenir a atrofia muscular e preservar as características das fibras musculares do bíceps braquial após um modelo de LME incompleta. Além disso, a EENM manteve parcialmente a redução do nível de IL-6 após a lesão neste músculo. Nós sugerimos que a EENM induziu a liberação de IL-6 no músculo, possivelmente ativando as células-satélites e aumentando os níveis de Akt fosforilada. No entanto, mais estudos são necessários para elucidar os mecanismos subsequentes da EENM nos músculos paralisados após a LME.

Conflito de Interesses Os autores não têm conflito de interesses a declarar.

Trabalho desenvolvido na Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC), Florianópolis, SC, Brasil.

Work carried out at the Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC), Florianópolis, SC, Brazil.
==== Refs
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