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Rev Bras Ortop (Sao Paulo)
Rev Bras Ortop (Sao Paulo)
10.1055/s-00042410
Revista Brasileira de Ortopedia
0102-3616
1982-4378
Thieme Revinter Publicações Ltda. Rua do Matoso 170, Rio de Janeiro, RJ, CEP 20270-135, Brazil

10.1055/s-0044-1788290
RBO-D-23-00315
Artigo Original
Joelho
Evaluation of the Mechanical Behavior of the Patellar and Semitendinosus Tendons Using Supersonic Shear-wave Imaging (SSI) Elastography and Tensile Tests
http://orcid.org/0009-0005-9097-4507
Fontenelle André 1
http://orcid.org/0000-0003-1881-5649
Mannarino Pietro 2
http://orcid.org/0000-0002-3937-8639
Oliveira Liliam Fernandes de 3
http://orcid.org/0000-0002-5855-4650
Menegaldo Luciano Luporini 3
http://orcid.org/0000-0002-7901-4805
Souza Sérgio Augusto Lopes de 4
http://orcid.org/0000-0003-1802-0037
Fontenelle César Rubens da Costa 1
1 Serviço de Traumato-Ortopedia, Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
2 Departamento de Ortopedia e Traumatologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
3 Programa de Engenharia Biomédica, Instituto Alberto Luiz Coimbra de Pós-Graduação e Pesquisa de Engenharia (Coppe), Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
4 Departamento de Radiologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Endereço para correspondência André Fontenelle, MD Rua Professor Rodolpho Paulo Rocco 255, Cidade Universitária21941-617, Ilha do Fundão, Rio de Janeiro, RJBrasilandrefontenelle97@gmail.com
04 9 2024
8 2024
1 9 2024
59 4 e556e563
20 11 2023
18 3 2024
The Author(s). This is an open access article published by Thieme under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License, permitting copying and reproduction so long as the original work is given appropriate credit ( https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ )
2024
The Author(s).
https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Objective  To analyze the mechanical properties of the patellar (PT) and semitendinosus (ST) tendons from fresh-frozen human cadavers from a tissue bank using supersonic shear-wave imaging (SSI) elastography and tensile tests.

Methods  We tested seven PT and five ST samples on a traction machine and performed their simultaneous assessment through SSI. The measurements enabled the comparison of the mechanical behavior of the tendons using the stress x strain curve and shear modulus (μ) at rest. In addition, we analyzed the stress x μ relationship under tension and tested the relationship between these parameters. The statistical analysis of the results used unpaired t -tests with Welch correction, the Pearson correlation, and linear regression for the Young modulus (E) estimation.

Results  The μ values for the PT and ST at rest were of 58.86 ± 5.226 kPa and 124.3 ± 7.231 kPa respectively, and this difference was statistically significant. The correlation coefficient between stress and μ for the PT and ST was very strong. The calculated E for the PT and ST was of 19.97 kPa and 124.8 kPa respectively, with a statistically significant difference.

Conclusion  The ST was stiffer than the PT in the traction tests and SSI evaluations. The μ value was directly related to the stress imposed on the tendon.

Clinical relevance  The present is an evaluation of the mechanical properties of the tendons most used as grafts in knee ligament reconstruction surgeries.

Keywords

elasticity imaging techniques
patellar tendon
Young's modulus
Suporte Financeiro Os autores declaram que não receberam suporte financeiro de agências dos setores públicos, privados, ou sem fins lucrativos para a realização deste estudo. Financial Support The authors declare that they have not received financial support from agencies in the public, private, or non-profit sectors to conduct the present study.
==== Body
pmcIntroduction

In recent decades, the mechanical properties of tendons have been widely studied, providing knowledge about their behavior. 1 2 3 4 Recently, the evaluation of the elastic modulus (E) and resistance to failure (RF) of tendon tissues gained importance in the literature. 5 In 2013, LaCroix et al. 5 showed an intimate relationship between these properties despite their conceptual distinction.

Publications on the matter employed several methods to measure these properties, but most carry biases. 3 6 7 8 9 10 11 12 13 14 The results of in-vivo studies are usually obtained indirectly from calculations combining magnetic resonance imaging and ultrasound with data provided by a dynamometer. 10 13 Several authors 2 3 6 9 11 12 14 have performed ex-vivo analyses of tendons from human and animal cadavers. However, the reliability of these studies is questionable due to the protocol preparation of cadaveric tissues. 10 15

We need new analysis methods including in-vivo studies and direct evaluation. Recently, ultrasound with elastography has been widely applied to evaluate tissue stiffness and measure it non-invasively, in real-time, and with less dependency on the operator's skill. 7 16 17 18 19 20

There are different elastography modalities, and the most recent is supersonic shear-wave imaging (SSI). 17 20 21 In this method, an acoustic radiation force generates shear waves in the tissue for detection by the ultrasound transducer. 14 17 21 The system provides the speed of these waves and the shear modulus (μ) of the tissue, expressing its stiffness. 12 14 17 19 21

The SSI is well-established in the evaluation of isotropic media, such as breast, liver, and thyroid tissues. 22 23 24 Despite requiring more robust validation, SSI has been used in musculoskeletal tissue, an anisotropic tissue, since the beginning of the last decade, with encouraging results. 1 6 7 8 16 18 19 20 25 26 27 Due to its anisotropic characteristic, the μ value of the tendon does not present the expected mathematical relationship with E. 14 17 21 Even so, recent studies 8 9 11 12 14 25 have demonstrated a strong correlation between the μ of the tendon obtained by SSI and its E calculated by the linear phase of the stress x strain graph. However, most of these tests used tendons from other animal species, with low scientific evidence. 9 11 12 14

There are two studies 8 25 in the literature comparing ex-vivo mechanical behaviors of human tendons using SSI elastographic analysis. The present study aims to evaluate the mechanical properties of the patellar (PT) and semitendinosus (ST) tendons due to their great relevance and use as grafts in knee ligament reconstruction surgeries 28 using SSI and dynamometry.

The main objective was to obtain and compare the E value from PT and ST at stress by evaluating the stress x strain curve recorded by the traction machine. The secondary objectives were to obtain and compare the μ values of PT and ST in the ultrasound assessment at rest carried out with SSI and to evaluate the influence of tissue stress in SSI-based evaluation, analyzing the correlation between μ values and the stress imposed on these tendons.

Materials and Methods

Ethical approval and study design

The institutional Ethics in Research Committee approved the present cross-sectional study under consubstantiated opinion 1,674,064 (CAAE: 26828914.3.0000.5257). The study was conducted at the Biomechanics Laboratory from 2019 to 2022.

The initial sample was composed of 14 PT and 19 ST samples from fresh-frozen human cadavers provided by the Brazilian Ministry of Health (MH) tissue bank. We received these tendons after they were considered unsuitable for surgical use, mainly due to contamination at some processing stage in the tissue bank. For the most part, the organism detected was Staphylococcus epidermidis , a bacterium that commonly colonizes human skin.

Tables 1 and 2 show the demographic distribution of the samples.

Table 1 Patellar tendon: demographic distribution

Gender	N	Mean age (years)	
Male	5	28.2 (22–35)	
Female	2	28 (26–30)	

Table 2 Semitendinosus tendon: demographic distribution

Gender	N	Mean age (years)	
Male	4	27.5 (22–35)	
Female	1	22	

The fact that tissues preserved in formaldehyde lose their mechanical properties warrants using fresh-frozen human tendons. 2 15 As such, we asked for samples from the MH since its protocol for preparing musculoskeletal tissues does not involve irradiation, avoiding damage to their biomechanical characteristics.

The inclusion criteria were tendons from fresh-frozen human cadavers aged between 20 and 35 years at the date of death and preserved in a freezer at -80° C at the tissue bank.

The exclusion criteria were signs of degenerative tendon disease, storage time longer than 2 years, presence of macroscopic ruptures, tendon irradiation during preparation by the tissue bank, and inadequate biomechanical or elastographic recording.

After applying the exclusion criteria and the occurrence of accidental damage to the tendons during the pretest preparation, we lost 7 PT and 14 ST samples, and 7 PT and 5 ST samples remained for the final analysis.

Sample preparation

We kept the samples in a freezer at -20° C at the Immunology Laboratory. For testing, the tendons were thawed one hour before at room temperature.

Preparation of the PT started after thawing the anatomical piece provided by the MH, which consisted of the entire knee extensor apparatus, with the quadriceps tendon, patella, patellar tendon, and tibial tuberosity. The pieces for testing were prepared with bone plugs in both PT attachments, with approximately 1.0 cm in each dimension. The intermediate tendinous part was approximately 1.0 cm wide ( Fig. 1 ). Each bone plug was drilled with a 2.5-mm drill, generating holes for passing Ethibond 5 wire (Ethicon, Inc., Raritan, NJ, United States).

Fig. 1 Patellar tendon (PT) prepared for the test.

Processing of the ST occurred before freezing in the tissue bank. Its length was standardized from the myotendinous junction to its tibial attachment. After thawing, we performed a Krakow suture with Ethibond 5 at both ends to optimize anchorage.

Both tendons were placed in the fixation system of the universal testing machine using metal claws ( Fig. 2 ).

Fig. 2 Metal fixing claws.

For the ST, we made two attempts before the definitive fixation to the metal claws. In the first attempt, the tendons were attached directly to the claws, which caused macroscopic structural damage in the first samples and loosening of their ends at the interface with the claws when the tensile test was still beginning. As a result, we abandoned this method. In the second attempt, we anchored the tendons by tying Ethibond 5 directly to plastic tubes attached to the claws. Once again, there were losses due to structural damage to the tissues and the generation of inadequate elastographic or biomechanical readings, so thbis method was also abandoned. After test failures with these two anchoring prototypes, we unfortunately lost 14 ST samples. Finally, to generate more effective fixation between the claw and the ST, we inserted them into plastic tubes, fixated them with Ethibond 5 threads, and attached them with conventional screws to a framework ( Figs. 3 4 ). This last method, deemed ideal and definitive, did not cause any damage or interference in data acquisition.

Fig. 3 Semitendinosus tendon (ST) inserted into tubes and fixated to the framework with screws.

Fig. 4 Final assembly of the ST.

Elastography

We used the Aixplorer equipment (SuperSonic Imagine, Aix-en-Provence, France) to acquire elastographic images with a linear transducer operating at frequencies ranging from 6 to 20 MHz. Before each test, we carefully aligned the transducer in the same direction as the tendon fibers using B-mode ultrasound ( Fig. 5A ), ensuring μ value determination in the same direction as that of the longitudinal traction.

Fig. 5 . ( A ) Tendon aligned in ultrasound (US) mode B. ( B ) Region of interest (ROI) in the elastography mode.

We activated the elastographic mode using the adapted musculoskeletal (MSK) preset, whose scale ranges from 0 to 800 kPa. The mapping area had a rectangular shape, enabling tendon delimitation. The test started after 10 seconds to stabilize the color mapping of the elastographic images ( Fig. 5B ).

We used an AUBO i5 robotic arm (AUDO Robotics, Beijing, China) ( Figs. 6 7 ) to collect the images, keeping the transducer fixed and immobile over the region of interest (ROI). A gel (Ultrex-gel, Farmativa Indústria e Comércio Ltda., Rio de Janeiro, RJ, Brazil) was used for the acoustic coupling on the tendon surface.

Fig. 6. Robotic arm maintaining linear transducer positioning.

Fig. 7 Transducer positioning during testing on the traction machine.

The μ analysis employed a specific routine developed by the Biomechanics Laboratory (trough the Matlab R2013a software, The MathWorks, Inc., Natick, MA, United States). We acquired elastography images until mapping saturation. At that moment, we terminated the video and stress.

Biomechanical testing

We used a BioPDI (São Carlos, SP, Brazil) tensile testing machine with a 5-kN load cell to perform tensioning tests. The temperature and relative humidity in the laboratory during the tests were standardized and kept constant at 23° C and 50% respectively. We attached the ends of the PT and ST samples to the metal claws from the tensioning machine. One end remained fixed, while the other end was progressively pulled at a 1-mm/minute speed on a uniaxial longitudinal axis.

The testing machine values consist of position (mm) and force (N). Using the Matlab software, data underwent a sixth-order Butterworth filtering. We performed an exponential third-order adjustment, ending with 0.5 splines. After the process, we calculated the stress and strain using the previously-measured initial length and cross-sectional area.

Statistical analysis

We calculated descriptive data, such as mean and standard deviation (SD). The Shapiro-Wilk test determined the distribution normality. The t -test for independent groups with Welch correction compared μ values at rest in the PT and ST samples. The Pearson correlation coefficient defined the relationship between μ under stress and tendon stress at moments of the stress x strain curve. Linear regression was performed on the distributions to measure the slope of the curve. E calculation used the slope -1 formula, since stress was selected as the independent variable on the x-axis. Values of p  < 0.05 were considered significant. The analyses were performed using the GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, United States) software, version 7.0.

Results

Shear modulus at rest

The initial μ value (with no stress) of the ST was higher compared with that of the PT, which was statistically significant (ST = 124.3 ± 7.231 kPa; and PT = 58.86 ± 5.226; p  = 0.0059) ( Fig. 8 ).

Fig. 8 Shear modulus (μ) of the PT and ST at rest. Note: * p  < 0.05.

Correlation between shear modulus and stress

The μ value presented a very strong correlation with stress for both tendons (PT: R = 0.9507; p  < 0.0001; and ST: R = 0.9528; p  < 0.0001) ( Table 3 ).

Table 3 Shear modulus (μ) x stress correlation

Correlation coefficient (R)	N	μ x stress	p	
Patellar tendon	7	0.9507 (0.839–0.985)	< 0.0001	
Semitendinosus tendon	5	0.9528 (0.845–0.986)	< 0.0001	

Variation of shear modulus under stress

The variation in μ values from ST and TP under stress presented no statistically significant difference (ST: slope of 0.664 ± 0.063 kPa; and PT: 0.872 ± 0.085 kPa; p  = 0.065). However, there was a statistically significant difference regarding the μ values of the tendons, especially noted at lower stresses (ST: an increase of 116.8–133.3 kPa; and PT: an increase of 47.14–69.31 kPa; p  < 0.0001) ( Fig. 9 ).

Fig. 9 Stress x shear modulus (µ) relationship. Note: * p  < 0.05.

Percentage of strain under stress and Young modulus

The ST showed significantly higher resistance to deformation than PT (ST: slope of 0.05 ± 0.005; and PT: slope of 0.008 ± 0.0002; p  < 0.0001). There was a statistically significant difference between the calculated E of the tendons (ST = 124.8 kPa; and PT = 19.97 kPa; p  < 0.0001) ( Fig. 10 ).

Fig. 10 Stress x strain relationship. Note: * p  < 0.05.

Discussion

Studying the mechanical properties of tendons provides information about their function and disease prevention and treatment. 1 3 18 26 27 29 In this context, the ST and PT are critical due to their wide use as grafts in surgeries for ligament reconstruction. 28

The present study used tendons from fresh-frozen cadavers provided by the MH, not damaged by formaldehyde or ionizing radiation, enabling the evaluation of the stress x strain curve and computation of the relationship between the stress and the strain. The ST showed significantly higher resistance to strain under stress than the PT ( p  < 0.0001). We also observed a significant difference for the calculated E, showing a much higher value in the ST (ST = 124.8 Kpa; and PT = 19.97 Kpa; 0  < 0.0001). We compared μ values from the PT and ST obtained through ultrasound with SSI assessment at rest. Again, the ST was stiffer than the PT (ST = 124.3 ± 7.231 kPa; and PT = 58.86 ± 5.226 Kpa; p  = 0.0059), showing agreement between the results obtained with SSI and those from the tensile tests. We also recorded the influence of tissue stress on the SSI assessment, showing that the greater the stress applied, the greater the μ recorded in both tendons, with a very strong correlation between the parameters (PT: R = 0.9507; p  < 0.0001; and ST: R = 0.9528; p  < 0.0001).

In the last decades the relevance of the SSI in real-time in-vivo tendon evaluation has been demonstrated. 7 18 19 20 26 27 29 A series of studies 19 29 30 have drawn attention to the importance of standardizing image acquisition, especially regarding the position of the limb examined. In 2019, for the first time, a study 8 showed the intimate relationship between the μ recorded using SSI and the stress imposed on a non-formolized human tendon; however, this work used a single specimen, presenting a low level of evidence. In the present study, we repeated this testing with two types of tendons (PT and ST), using 12 samples, showing a very strong and statistically significant correlation between these two variables. This sheds new light on the use of tendon assessment with SSI. From this moment on, it becomes critical to control the muscular action over the tendon studied, as this can significantly affect the elastographic record.

The current literature 9 12 consistently demonstrates the relationship between E and μ, although not respecting the classic mathematical estimate. Recently, in 2023, Brandão et al. 25 studied 5 PTs and 11 calcaneus tendons from fresh-frozen human cadavers, finding a strong correlation between the variation in μ recorded by SSI with the E calculated by the stress x strain curve in the biomechanical test. In the present study, stiffness was higher in the ST than in the PT, both in the SSI and the traction test, with statistical significance. This suggests that SSI can reliably measure the mechanical properties of tendons in a way comparable to the gold standard.

In the context of using the PT and ST as grafts for ligament reconstruction, it is interesting that these tendons not only present high RF but also elastic characteristics similar to those of the native ligament. Previous studies 5 11 have revealed a statistically significant correlation between μ and RF in normal animal tendons. Likewise, a reduction in μ and RF has been described in diseased or chemically-damaged tendons. 11 14 Therefore, SSI may be particularly useful in assessing tendons and decision-making for graft selection. However, none of these studies performed such tests on human tendons.

The findings of the present study are consistent with those of Fontenelle et al. 19 who, in 2018, reported that the in-vivo μ value of the ST was higher than that of the PT in relaxed and stressed states. This may suggest the choice of the ST when reconstructing a more rigid structure.

It is worth highlighting certain limitations of the present study. Although we obtained consistent E values by calculating the slope of the stress x strain curve, 19 the trendons were not brought to failure. The tests were interrupted when the SSI reached saturation, and the region of elastic strain of the tendon may not have been reached, which would compromise the E estimate. Furthermore, despite all care, tendon fixation to the metal claws of the traction machine was particularly difficult when there was no bone plug. This difficulty can generate micromovements at the tendon-claw interface, underestimating the deformation record obtained. Future studies must consider this.

Finally, the most appropriate graft depends on the mechanical behavior not only of the tendon, but also of the ligaments for replacement. Future research in this field should pay particular attention to the biomechanical analysis of these ligaments.

Conclusion

The ST was stiffer than the PT both in the traction test and SSI evaluation at rest and under stress, with μ values revealing a direct relationship with the stress imposed on the tendon during its assessment.

Avaliação do comportamento mecânico dos tendões patelar e semitendinoso utilizando a elastografia por ondas de cisalhamento (SSI) e testes de tração
Resumo

Objetivo  Analisar as propriedades mecânicas dos tendões patelar (TP) e semitendinoso (ST) obtidos de cadáveres humanos congelados enquanto ainda frescos, provenientes de banco de tecidos, utilizando elastografia por ondas de cisalhamento ( supersonic shearwave imaging , SSI, em inglês) e testes de tração.

Métodos  Sete amostras de TP e cinco de ST foram testadas em máquina de tração e simultaneamente avaliadas por SSI. As medidas geradas possibilitaram comparar o comportamento mecânico dos tendões por curva stress x strain e módulo de cisalhamento (μ) em repouso. Também foi analisada a relação stress x μ sob tensão, e testada a relação entre esses parâmetros. Os resultados foram submetidos a análise estatística pelos testes t não-pareado com correção de Welch, correlação de Pearson e regressão linear para estimativa do módulo de Young (E).

Resultados  O μ dos TP e ST em repouso foi, respectivamente, de 58,86 ± 5,226 kPa e 124,3 ± 7,231 kPa, com diferença estatisticamente significativa. O coeficiente de correlação entre stress e μ dos TP e ST foi classificado como muito forte. O E calculado dos TP e ST foi, respectivamente, de 19,97 kPa e 124,8 kPa, com diferença estatisticamente significativa.

Conclusão  O ST foi mais rígido do que o TP nos testes de tração e nas avaliações por SSI. O μ esteve diretamente relacionado com o stress a que o tendão é submetido.

Relevância clínica  Avaliar as propriedades mecânicas dos tendões mais utilizados como enxerto nas cirurgias de reconstrução ligamentar do joelho.

Palavras-chave

módulo de Young
técnicas de imagem por elasticidade
tendão patelar
Introdução

Nas últimas décadas, as propriedades mecânicas dos tendões foram amplamente estudadas, o que proporcionou conhecimento sobre seu comportamento. 1 2 3 4 Recentemente, a avaliação do módulo de elasticidade (E) e da resistência à falha (RF) do tecido tendinoso ganhou importância na literatura. 5 Em 2013, LaCroix et al. 5 evidenciaram íntima relação entre essas propriedades, apesar de serem distintas conceitualmente.

Vários métodos de aferição dessas propriedades foram utilizados nas publicações sobre o tema, mas a maioria contém vieses. 3 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Os resultados dos estudos in vivo são habitualmente obtidos de maneira indireta, a partir de cálculos que associam imagens de ressonância magnética e ultrassonografia com dados fornecidos por dinamômetro. 10 13 Análises ex vivo de tendões de cadáveres humanos e de animais têm sido realizadas por diversos autores. 2 3 6 9 11 12 14 Contudo, a confiabilidade desses estudos é questionável pelo protocolo de preparo dos tecidos cadavéricos estudados. 10 15

Surgiu a necessidade de novos métodos de análise que contemplassem estudos in vivo e avaliação direta. Recentemente, a ultrassonografia associada à elastografia vem sendo amplamente aplicada para avaliar a rigidez dos tecidos, pois é capaz de aferi-la de maneira não invasiva, em tempo real, menos dependente da habilidade do operador. 7 16 17 18 19 20

Existem diferentes modalidades de elastografia, e a mais recentemente desenvolvida foi a elastografia por ondas de cisalhamento ( supersonic shear-wave imaging , SSI, em inglês). 17 20 21 Nesse método, uma força de radiação acústica gera ondas de cisalhamento no tecido, que são detectadas pelo transdutor ultrassonográfico. 14 17 21 A velocidade dessas ondas e o módulo de cisalhamento (μ) do tecido são fornecidos pelo sistema, e expressa a rigidez. 12 14 17 19 21

O uso da SSI está bem estabelecido para a avaliação de meios isotrópicos, como os tecidos mamário, hepático e tireoidiano. 22 23 24 Apesar de necessitar de validação mais robusta, desde o início da última década a SSI tem sido utilizada no tecido musculoesquelético, um tecido anisotrópico, e o método encontra-se em ascensão promissora. 1 6 7 8 16 18 19 20 25 26 27 Por sua característica anisotrópica, o μ do tendão não apresenta a relação matemática esperada com o E. 14 17 21 Apesar disso, estudos recentes 8 9 11 12 14 25 demonstraram forte correlação entre o μ do tendão obtido pela SSI e seu E calculado pela fase linear do gráfico stress x strain . Contudo, a maioria desses ensaios utilizou tendões de outras espécies animais, e são de baixa evidência científica. 9 11 12 14

Há na literatura dois estudos 8 25 que comparam o comportamento mecânico de tendões humanos ex vivo com a análise elastográfica feita pela SSI. O presente estudo visa avaliar as propriedades mecânicas dos tendões patelar (TP) e semitendinoso (ST), por sua grande relevância e utilização como enxerto nas cirurgias de reconstrução ligamentar do joelho, 28 por meio da SSI e da dinamometria.

O objetivo principal foi obter e comparar o E do TP e ST ao tensionamento, pela avaliação da curva stress x strain registrada na máquina de tração. Os objetivos secundários foram obter e comparar o μ do TP e ST na avaliação ultrassonográfica em repouso por SSI e analisar a influência da tensão tecidual na avaliação pela SSI, por meio da análise da correlação entre o μ e o stress aplicado a esses tendões.

Materiais e Métodos

Declaração de ética e desenho experimental

Foi realizado um estudo transversal, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da instituição, sob o parecer consubstanciado 1.674.064 (CAAE: 26828914.3.0000.5257), desenvolvido no Laboratório de Biomecânica de 2019 a 2022.

A amostra inicial era composta por 14 amostras de TP e 19 de ST, obtidas de cadáveres humanos congelados enquanto ainda frescos, fornecidos pelo banco de tecidos do Ministério da Saúde (MS). O fornecimento de tais tendões ocorreu após eles serem considerados inaptos para a utilização em cirurgias, principalmente por contaminação em alguma fase do processamento no banco de tecidos. Em sua maioria, o microrganismo detectado foi o Staphylococcus epidermidis , bactéria que comumente coloniza a pele de seres humanos.

A distribuição demográfica das amostras está demonstrada nas Tabelas 1 e 2 .

Tabela 1 Distribuição demográfica do tendão patelar

Gênero	N	Idade média (anos)	
Masculino	5	28,2 (22–35)	
Feminino	2	28 (26–30)	

Tabela 2 Distribuição demográfica do tendão semitendinoso

Gênero	N	Idade média (anos)	
Masculino	4	27,5 (22–35)	
Feminino	1	22	

O uso de tendões humanos congelados enquanto ainda frescos se justificou pelo fato de que tecidos conservados em formol perdem suas propriedades mecânicas. 2 15 Nesse sentido, optou-se por obter o material amostral do MS, pois o ministério tem como protocolo preparar os tecidos musculoesqueléticos sem irradiá-los, o que evita danos às suas características biomecânicas.

Os critérios de inclusão foram: tendões de cadáveres humanos congelados enquanto ainda frescos, com idades entre 20 e 35 anos na data do falecimento, e conservação em freezer com temperatura de -80° C no banco de tecidos.

Os critérios de exclusão foram: sinal de doença degenerativa nos tendões, tempo de armazenamento superior a dois anos, presença de rupturas macroscópicas, irradiação dos tendões no preparo pelo banco de tecidos e registro biomecânico ou elastográfico inadequado.

Após a aplicação dos critérios de exclusão e a ocorrência de danos acidentais aos tendões durante o preparo pré-teste, houve perda de 7 amostras de TP e 14 de ST, e restaram 7 amostras de TP e 5 de ST para a análise final.

Preparo das amostras

As amostras foram mantidas em ambiente refrigerado a -20°C em freezer do Laboratório de Imunologia. Para a testagem, os tendões foram descongelados uma hora antes em temperatura ambiente.

O TP foi preparado após o descongelamento da peça anatômica fornecida pelo MS, que consistia no aparelho extensor do joelho por inteiro, com tendão quadricipital, patela, TP e tuberosidade da tíbia. Foram confeccionadas as peças para a testagem com plugs ósseos em ambas as inserções do TP, cada uma medindo aproximadamente 1,0 cm em cada dimensão, e a parte tendinosa intermediária, com aproximadamente 1,0 cm de largura ( Fig. 1 ). Cada plug ósseo foi perfurado com broca de 2,5 mm, o que gerou orifícios para a passagem de fio Ethibond 5 (Ethicon, Inc., Raritan, NJ, Estados Unidos).

Fig. 1 Tendão patelar (TP) preparado para o teste.

O ST teve processamento prévio ao congelamento no banco de tecidos. Seu comprimento foi padronizado desde a junção miotendínea até a sua inserção tibial. Após o descongelamento, foi aplicada sutura tipo Krakow com Ethibond 5 em ambas as extremidades, para otimizar a ancoragem.

Em ambos os tendões, foi utilizado o sistema de fixação à máquina universal de ensaio por garras metálicas ( Fig. 2 ).

Fig. 2 Garras metálicas de fixação.

No ST, previamente ao método definitivo de fixação às garras metálicas, foram feitas duas tentativas. Na primeira, os tendões foram presos diretamente às garras, o que provocou dano estrutural macroscópico nas primeiras amostras e soltura de suas extremidades na interface com as garras quando o teste de tração ainda se iniciava, e o método foi abandonado. Em uma segunda tentativa, a ancoragem dos tendões foi realizada amarrando o Ethibond 5 diretamente a tubos plásticos, que foram presos às garras. Mais uma vez, houve perdas por danos estruturais aos tecidos e geração de leitura elastográfica ou biomecânica inadequada, e o método também foi abandonado. Após o fracasso dos testes com esses dois protótipos de ancoragem, infelizmente foram totalizadas 14 perdas de amostras de ST. Finalmente, para gerar fixação mais eficaz entre a garra e o ST, estes foram inseridos em tubos plásticos e fixados a eles com fios Ethibond 5, presos a parafusos convencionais a cavaleiro ( Figs. 3 4 ). Este último método, tido como ideal e definitivo, não causou qualquer dano ou interferência na aquisição dos dados.

Fig. 3 Tendão semitendinoso (ST) inserido em tubos e fixado a cavaleiro em parafusos.

Fig. 4 Montagem final do ST.

Elastografia

Para a aquisição das imagens elastográficas, foi utilizado o equipamento Aixplorer (SuperSonic Imagine, Aix-en-Provence, França), com transdutor linear operando na frequência de 6 a 20MHz. Antes de cada teste, o transdutor foi cuidadosamente alinhado no mesmo direcionamento das fibras tendinosas, utilizando o modo B do ultrassom ( Fig. 5A ), garantindo que o μ fosse medido no mesmo sentido da tração longitudinal.

Fig. 5 . ( A ) Tendão alinhado na ultrassonografia (US) modo B. ( B ) Região de interesse (RI) no modo elastografia.

O modo elastográfico foi ativado utilizando-se o preset musculoskeletal (MSK) adaptado, cuja escala varia de 0 a 800 kPa. A área de mapeamento teve forma retangular, o que permitiu a delimitação do tendão. Para estabilização do mapeamento em cores das imagens elastográficas ( Fig. 5B ), o teste foi iniciado após 10 segundos.

Um braço robótico AUBO i5 (AUBO Robotics, Pequim, China) ( Figs. 6 7 ) foi utilizado na coleta das imagens, e manteve-se o transdutor fixo e imóvel, posicionado sobre a região de interesse (RI). Utilizou-se gel (Ultrex-gel, Farmativa Indústria e Comércio Ltda., Rio de Janeiro, RJ, Brasil) para o acoplamento acústico na superfície do tendão.

Fig. 6. Braço robótico mantendo posicionamento do transdutor linear.

Fig. 7 Posicionamento do transdutor durante o teste na máquina de tração.

Na análise do μ, foi utilizada uma rotina própria desenvolvida pelo Laboratório de Biomecânica (por meio do programa Matlab R2013a, The MathWorks, Inc., Natick, MA, Estados Unidos). A aquisição das imagens da elastografia foi feita até o momento da saturação do mapeamento. Nesse instante, o vídeo e o tensionamento eram interrompidos.

Testagem biomecânica

Na realização dos testes de tensionamento, foi utilizada máquina de ensaio de tração Biopdi (São Carlos, SP, Brasil) com célula de carga de 5 kN. A temperatura e a umidade relativa do ar no laboratório durante os testes foram padronizadas e mantidas constantes, a 23 ° C e 50%, respectivamente. O TP e o ST foram presos em suas extremidades às garras de metal que se acoplam à máquina de tensionamento, com uma das extremidades ficando fixa enquanto a outra era progressivamente tracionada a uma velocidade de 1 mm/min, num eixo longitudinal uniaxial.

Os valores da máquina de ensaio foram referentes à posição (mm) e à força (N). Por meio do programa Matlab, os dados foram filtrados no filtro butterworth de ordem 6. Foi feito ajuste exponencial de ordem 3, e finalizou-se com splines de 0,5. Após o processo, foram calculadas a tensão ( stress ) e a deformação ( strain ), utilizando o comprimento inicial e a área de secção transversa, medidos anteriormente.

Análise estatística

Os dados descritivos, como desvio padrão (DP) e média, foram calculados. A normalidade das distribuições foi calculada pelo teste de Shapiro-Wilk. O teste t para grupos independentes, com correção de Welch, foi aplicado para comparação do μ em repouso entre TP e ST. O coeficiente de correlação de Pearson foi utilizado para a relação entre o μ sob tensão com o stress dos tendões, em instantes da curva stress x strain . Foi realizada regressão linear sobre as distribuições para a obtenção da medida da inclinação ( slope ) da curva. O E foi calculado pela fórmula slope -1 , pois optou-se pelo stress como variável independente no eixo x. valores de p  < 0,05 foram considerado significativos. As análises foram realizadas por meio do programa GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, Estados Unidos), versão 7.0.

Resultados

Módulo de cisalhamento em repouso

O μ inicial (sem tensionamento) do ST foi superior ao do TP, de forma estatisticamente significativa (ST = 124,3 ± 7,231 kPa; TP = 58,86 ± 5,226; p  = 0,0059) ( Fig. 8 ).

Fig. 8 Módulo de cisalhamento (μ) do TP e do ST, em repouso. Nota: * p  < 0,05.

Correlação entre módulo de cisalhamento e stress

O μ apresentou uma correlação considerada muito forte com o stress para ambos os tendões (R = 0,9507; p  < 0,0001 para o TP; e R = 0,9528; p  < 0,0001 para o ST) ( Tabela 3 ).

Tabela 3 Correlação módulo de cisalhamento (μ) x stress

Coeficiente de correlação (R)	N	μ x stress	p	
Tendão patelar	7	0,9507 (0,839–0,985)	< 0,0001	
Tendão semitendinoso	5	0,9528 (0,845–0,986)	< 0,0001	

Variação do módulo de cisalhamento no stress

A variação do μ do ST e do TP sob stress não apresentou diferença estatisticamente significativa (ST: inclinação de 0,664 ± 0,063 kPa; TP: inclinação de 0,872 ± 0,085 kPa; p  = 0,065). Entretanto, foi observada uma diferença estatisticamente significativa entre o μ dos tendões, especialmente notada em tensões menores (ST: elevação de 116,8–133,3 kPa; TP: elevação de 47,14–69,31 kPa; p  < 0,0001) ( Fig. 9 ).

Fig. 9 Relação stress x módulo de cisalhamento (µ). Nota: * p  < 0,05

Deformação percentual ( strain ) sob stress e módulo de Young

O ST apresentou maior resistência à deformação do que o TP, com diferença estatisticamente significativa (ST: inclinação de 0,05 ± 0,005; TP: inclinação de 0,008 ± 0,0002; p  < 0,0001). Uma diferença estatisticamente significativa foi observada com relação ao E calculado dos tendões (ST = 124,8 kPa; TP = 19,97 kPa; p  < 0,0001) ( Fig. 10 ).

Fig. 10 Relação stress x strain . Nota: *p< 0,05

Discussão

O estudo das propriedades mecânicas dos tendões traz informações sobre sua função, prevenção e tratamento de doenças. 1 3 18 26 27 29 Neste contexto, o ST e o TP se destacam em importância pela sua vasta utilização como enxerto em cirurgias de reconstrução ligamentar. 28

Neste estudo, foram utilizados tendões de cadáveres congelados enquanto ainda frescos, cedidos pelo MS, não danificados por formol ou radiação ionizante, o que possibilitou avaliar a curva stress x strain e computar a relação entre o stress e o strain . O ST apresentou maior resistência ao strain sob stress do que o TP, com diferença estatisticamente significativa ( p  < 0,0001). Isso também foi observado com o E calculado, que apresentou valor muito superior no ST (ST = 124,8 KPa; TP = 19,97 KPa; p  < 0,0001). Foi comparado o μ do TP ao do ST, obtidos por meio da avaliação ultrassonográfica em repouso feita por SSI. Novamente, o ST foi mais rígido do que o TP (ST = 124,3 ± 7,231 kPa; TP = 58,86 ± 5,226 KPa; p  = 0,0059), o que evidencia a concordância entre os resultados obtidos pela SSI e os dos testes de tração. Ainda foi registrada a influência da tensão tecidual na avaliação pela SSI, que evidenciou que, quanto maior o stress aplicado, maior o μ registrado em ambos os tendões, havendo correlação muito forte entre os parâmetros (TP: R = 0,9507; p  < 0,0001: e ST: R = 0,9528;. p  < 0,0001).

Nas últimas décadas, tem sido demonstrada a relevância da SSI na avaliação dos tendões in vivo como uma técnica realizada em tempo real. 7 18 19 20 26 27 29 Uma série de trabalhos 19 29 30 chamaram a atenção para a importância de padronizar a obtenção das imagens, especialmente quanto à posição do membro examinado. Em 2019, foi publicado pela primeira vez estudo 8 que evidencia a relação íntima entre o μ registrado na SSI e o stress ao qual é submetido um tendão humano não formolizado. No entanto, tal trabalho utilizou apenas um espécime, e apresentou baixo nível de evidência. No presente estudo, repetiu-se essa testagem com 2 tipos de tendões (TP e ST), e foram utilizadas 12 amostras; evidenciou-se correlação muito forte entre essas duas variáveis, com significância estatística. Isso traz uma nova luz sobre o uso da avaliação de tendões por SSI. A partir deste momento, torna-se de fundamental importância controlar a ação muscular atuante sobre o tendão estudado, pois esta pode afetar significativamente o registro elastográfico.

A literatura atual demonstra consistentemente a relação entre o E e o μ, embora não respeitando a estimativa matemática clássica. 9 12 Recentemente, em 2023, Brandão et al. 25 estudaram 5 TPs e 11 tendões aquileus de cadáveres humanos congelados enquanto ainda frescos, e encontraram forte correlação entre a variação do μ registrado na SSI com o E calculado pela curva stress x strain no teste biomecânico. No presente trabalho, foi observada maior rigidez do ST do que do TP, tanto na SSI quanto no teste de tração, com significância estatística. Isto sugere que a SSI é capaz de aferir as propriedades mecânicas dos tendões de forma confiável, comparável ao padrão-ouro.

No contexto da utilização do TP e do ST como enxertos para reconstrução ligamentar, é interessante que esses tendões não só apresentem uma grande RF, como também características elásticas semelhantes às do ligamento nativo. Estudos prévios 5 11 revelaram correlação estatisticamente significativa entre o μ e a RF em tendões animais normais. Da mesma forma, foi descrita redução do μ e da RF em tendões doentes ou danificados quimicamente. 11 14 Portanto, a SSI pode ser particularmente útil na avaliação de tendões e na tomada de decisão na escolha do enxerto. No entanto, nenhum destes trabalhos realizou tais testagens em tendões humanos.

Os achados deste estudo são semelhantes aos de Fontenelle et al. 19 em 2018, em que o μ do ST foi superior ao do TP em estados relaxado e tensionado, in vivo . Isto pode sugerir a escolha do ST na reconstrução de uma estrutura mais rígida.

É importante ressaltar algumas limitações do presente ensaio. Apesar de terem sido obtidos valores consistentes para o E pelo cálculo da inclinação da curva stress x strain , 19 os tendões não foram levados até a falha. Os testes foram interrompidos ao atingir a saturação da SSI, sendo possível que ainda não tivesse sido atingida a região de deformação elástica linear do tendão, o que comprometeria a estimativa do E. Além disso, apesar de terem sido tomados todos os cuidados possíveis, a fixação dos tendões às garras metálicas da máquina de tração se revelou particularmente difícil quando não havia um plug ósseo. Isso pode gerar micromovimentos na interface tendão-garra, e uma subestimação do registro de deformação obtido. Futuros estudos devem considerar isso.

Por último, o enxerto mais adequado depende do comportamento mecânico não só do tendão, como também dos ligamentos a serem substituídos. As próximas pesquisas nesta área devem dedicar particular atenção à análise biomecânica desses ligamentos.

Conclusão

O ST foi mais rígido do que o TP, tanto no teste de tração quanto na avaliação pela SSI em repouso e sob tensão, sendo que o μ revelou relação direta com o stress ao qual o tendão é submetido durante sua avaliação.

Conflito de Interesses Os autores não têm conflito de interesses a declarar.

Trabalho desenvolvido no Serviço de Traumato-Ortopedia do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil.

Work carried out at the Traumatology and Orthopedics Service, Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.
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